Конкурс «Био/Мол/Текст»-2023/2024

Эта работа заняла второе место в спецноминации «Академия и бизнес» конкурса «Био/Мол/Текст»-2023/2024, а также будет опубликована в журнале «Химия и жизнь».

Генеральный партнер конкурса и партнер этой номинации — международная инновационная биотехнологическая компания BIOCAD.

---

«Книжный» спонсор конкурса — «Альпина нон-фикшн»

Представьте, что вы просыпаетесь в своей уютной квартире в 2040 году. Луч солнца, проникая сквозь стекло, озаряет всю комнату, побуждая вас открыть глаза. Этот день, как и все предыдущие, вы проводите в «eco-conscious lifestyle». Вы потягиваетесь, берете телефон в руки, но перед тем как зайти в Телеграм, читаете статистику своего сна в приложении от стартапа Eightsleep, чей «умный» матрас отслеживает ваш режим сна, регулирует температуру в течение ночи и предоставляет персонализированную информацию о сне. Встав с кровати, вы проверяете термодатчики Ecobee, которые оптимизируют потребление энергии и обеспечивают комфорт в домах и направляетесь на кухню.

По пути вы замечаете стоящую в прихожей сумку из кожи, при создании которой ни одно животное не пострадало, — от стартапа Modern Meadow (сумки Louis Vuitton давно уже не в моде). Вместо того, чтобы выращивать животных для забоя, компания Modern Meadow производит кожу биофабрикацией, в которой перепрограммированные клетки кожи вырабатывают коллаген, идентичный коллагену крупного рогатого скота или другого желаемого животного. В результате получается кожа, биологически идентичная традиционной.

Вы заходите в ванную комнату, где на полке рядом с зубной пастой соседствует инновационный крем от стартапа Geltor. Как известно, большая часть косметики и уходовых средств за кожей производится из побочных продуктов животного хозяйства. Сквалан получают из жира печени акулы, желатин — из костей, сухожилий и связок коров и свиней; а ланолин — из шерстяного жира животных. Geltor предлагает альтернативу — использование ферментации с получением клеточного белка со свойствами, идентичными выше указанным веществам. Окинув все вокруг безразличным взглядом, вы идете на кухню, силой мысли включаете свет и, наконец, начинаете инновационное путешествие в мир кулинарии будущего.

Начнем с простого — отрываете свежий салат, выращенный в специальной вертикальной «теплице» от Bowery Farming. Этот нью-йоркский стартап реализует технологию вертикального земледелия в закрытых помещениях, которая использует на 95% меньше воды, чем традиционные методы сельского хозяйства, и позволяет выращивать свежие продукты круглый год у себя на кухне.

Приоткрыв холодильник, вы внезапно оказываетесь во вселенной инновационных продуктов, созданных с особым вниманием к экологической устойчивости процессов. Ни намека на полиэтилен: все упаковано в защитную пленку из бурых морских водорослей от Notpla. Эта биопленка разлагается естественным образом в течение 4–6 недель, и ее можно использовать для компостирования в домашних условиях.

Все фрукты и овощи покрыты защитным слоем от стартапа Apeel. Консервант для покрытия Apeel содержит кутин — полиэфир, который в природе находится во внешнем слое оболочки клеток эпидермиса растений и служит защитным средством от насекомых. Липиды, содержащиеся в кутине, используются в консервирующем растворе для создания пленки, которая защищает продукт от разложения. Стартап Apeel утверждает, что использование их покрытия на авокадо позволяет экономить воду и энергию, а также удваивает период созревания фрукта.

*Вздох…* Ваш взгляд сразу же падает на лежащую на боковой полке манящую шоколадку от WNWN Food Labs без содержания какао. Известно, что производство шоколада способствует вырубке лесов и, как следствие, изменению климата [1]. С 1990 года около 80% тропических лесов Западной Африки и Гвинеи подверглись вырубке лесов, чтобы освободить больше места для производства какао [2]. В среднем при производстве 1 кг какао-бобов выбрасывается 1,47 кг CO₂-экв [3]; однако, по словам WNWN, при производстве их продукции выделяется на 80% меньше углекислого газа в сравнении с традиционной технологией создания шоколада из какао. Процесс получения шоколада основан на запатентованной технологии точной ферментации, только вместо ферментации и обжарки какао-бобов WNWN производит альтернативный шоколад из ферментированного ячменя и цератонии (рожкового дерева) (рис. 1).

Сдержав свой порыв начать день со сладкого, вы все-таки решаетесь закончить введение, и, вытащив нужные продукты из холодильника, мы переходим к главе 1.

Глава 1. Утро начинается с кофе без кофеина

Британский стартап Tropic Biosciences — новая сельскохозяйственная компания, использующая технологии генного редактирования и специализирующаяся на разработке и коммерциализации высокоэффективных сортов трех ключевых тропических культур: кофе, бананов и риса. Миссия компании: использовать генетические технологии для тропических культур и регионов — ведущих производителей сельскохозяйственной продукции, страдающих также от проблем бедности и изменения климата. Компания Tropic Biosciences считает, что ее технология может улучшить жизни более полумиллиарда человек по всему миру.

Кофеин — знаменитый компонент кофе — играет важную роль в регулировании сна, может его нарушать и вызывать чувство беспокойства [4]. Кофе без кофеина позволяет людям наслаждаться всеми преимуществами этого ароматного напитка, избегая негативных последствий содержащегося в нем алкалоида. Кофеина там нет, зато есть полифенолы, которые способны снизить окислительный стресс и воспаление в организме. В ходе одного исследования было установлено, что регулярное употребление двух или более чашек декофеинизированного кофе уменьшает риск развития рака толстой и прямой кишки [5].

В настоящее время для производства кофе без кофеина применяется дорогостоящий и неэкологичный процесс, в ходе которого зерна замачиваются и подвергаются термообработке паром. Однако использование генной инженерии для получения кофе без кофеина не только экологичнее, но и позволяет создать сорт, обладающий наиболее традиционным вкусом и сохраняющий изначальное содержание полезных соединений.

Стартап Tropic Biosciences создал генетически модифицированный сорт кофейных зерен с пониженным содержанием кофеина, используя предложенную им же технологию GEiGS® (Gene Editing induced Gene Silencing), тем самым «выключив» гены, отвечающие за выработку этого алкалоида (рис. 2).

Геном всех организмов содержит гены, продукт которых — матричные РНК (мРНК), используемые клеткой для последующего синтеза белка. Однако также геномы содержат некодирующие участки — они не кодируют белок, но, тем не менее, могут кодировать разнообразные прочие молекулы РНК, среди которых — малые интерференционные (миРНК), лежащие в основе явления, известного как РНК-интерференция [6], при котором выборочно подавляется экспрессия генов. Короткие цепочки миРНК «вмешиваются» в экспрессию генов, комплементарно связываясь с определенной мРНК и способствуя ее деградации (а без них, понятно, не будет и белка).

Технология основана на анализе информации о последовательностях таких некодирующих «генов» в организме-хозяине, их экспрессионных паттернах, а также о последовательностях генов-мишеней, которые нужно «отключить» (все это делается на платформе GEiGS-BioCompute). На основе этих данных определяется конкретное место для редактирования ДНК в соответствии с параметрами: выбор нуклеазы, используемой для внесения изменений, тканевой специфичности результирующей миРНК и прогнозируемой эффективности подавления гена.

Далее следует этап собственно редактирования генов (на базе, например, методик CRISPR/Cas [7] или TALEN [8]) для внесения минимальных и специфичных изменений всего в несколько нуклеотидов в некодирующих участках ДНК организма-хозяина. В результате изменяется последовательность синтезируемой миРНК, что приводит к прицельному перенаправлению ее подавляющей активности на новый ген-мишень и уменьшает количество производимого им белка. Для получения кофе без кофеина Tropic Biosciences редактирует собственные (эндогенные) гены растения (как раз те, что отвечают за выработку кофеина). А для разработки новых сортов бананов и риса, устойчивых к вредителям и болезням, миРНК могут быть нацелены уже на экзогенные гены, принадлежащие патогенам или вредителям, таким как вирусы или грибы (см. рис. 3 и видео 1).

Тем не менее, кофе является лишь одним из компонентов завтрака, и настало время обратить внимание на белковую составляющую — яйца.

Глава 2. Яйца из грибов

Яичный белок — один из лучших природных источников питательных веществ (белка, липидов, витаминов и минералов), который используется для разных целей в пищевой промышленности [9]. Пену из яичного белка можно добавлять в различные блюда, такие как безе, пирожные, суфле, соусы, муссы и коктейли. В качестве связующего вещества яичные белки можно использовать для замеса теста, приготовления пирогов с заварным кремом и покрытия глазурью хлебобулочных изделий.

Яичный белок в основном состоит из воды (88%) и белков (11%), а оставшийся процент — углеводы, минеральные вещества и следовые количества липидов. В яичном белке содержатся не только питательные вещества, но и компоненты, которые играют важную роль в физиологических функциях организма (рис. 4) [9]. Основные белки яйца, такие как овальбумин, лизоцим и овотрансферрин (и недавно обнаруженные α-актин-2 и бецилин-1), также обладают антиоксидантными свойствами. Кроме того, яичный белок содержит цистатин и овостатин, которые выполняют антимикробную функцию. Еще одной важной категорией биологической активности являются белки, которые обладают антигипертензивными свойствами. Примерами таких белков являются овотрансферрин и муцин-5B (рис. 4) [10].

Участник многих метаболических реакций овальбумин (рис. 5) — основной белок белка 😊 (54% от общего состава белков) [11]; он состоит из 386 аминокислотных остатков и имеет молекулярную массу 45 кДа. Остальные белки — овотрансферрин (12%), овомукоид (11%), лизоцим (3,5%), овомуцин (3,5%), авидин (0,05%), цистатин (0,05%), овомакроглобулин (0,5%) и овофлавопротеин (0,8%) [9]. Каждый из этих белков играет свою роль: многофункциональный овотрансферрин связывает и доставляет железо, участвует в прочих транспортных путях, передаче сигналов и апоптозе (рис. 6) [12]; крупный гликозилированный овомуцин отвечает за гелеобразную структуру яичного белка [13]; овомукоид известен как ингибитор трипсина и считается основным пищевым аллергеном, присутствующим в яичном белке [10].

Однако белки содержатся не только в белке, но и в желтке — подробнее об этом рассказывает рис. 6.

Базирующийся в Финляндии стартап Onego Bio производит Bioalbumen™ — рекомбинантный белок на замену порошку, получаемому из куриных яиц. Стартап был номинирован на премию World Changing Ideas Awards 2023 от Нью-Йоркского журнала Fast Company. Предварительное исследование показало, что производство Bioalbumen™ с использованием гриба-аскомицета Trichoderma reesei по сравнению с традиционным производством яиц может снизить воздействие на окружающую среду по целому ряду категорий воздействия, таких как землепользование, подкисление суши, эвтрофикация морской среды и разрушение стратосферного озона [14].

Прецизионная ферментация — термин, используемый для описания оптимизированных биотехнологических процессов ферментации с использованием специально разработанных микроорганизмов в качестве «клеточных фабрик» для производства многофункциональных пищевых ингредиентов (ферментов, липидов, углеводов, витаминов, ароматизаторов, красителей, антиоксидантов и консервантов) с высоким выходом и чистотой [15]. Метаболическая инженерия — основное направление прецизионной ферментации, включающее генное редактирование микроорганизмов с использованием биоинформатических подходов, NGS [16], молекулярного клонирования [17], сравнительного мультиомиксного анализа [18] и технологий CRISPR/Cas9.

Теперь пришло время использовать тот же технологический процесс для производства биоальбумина, где обычно требуются цыплята. Для производства биоальбумина с помощью прецизионной ферментации стартап Onego Bio использует гриб-аскомицет Trichoderma reesei (рис. 7). В методе, аналогичном производству пива, к культивируемым микроорганизмам подают воду, сахара и минеральные вещества для получения биоальбумина.

Кодирующая последовательность гена SERPINB14 биоальбумина клонируется в экспрессионный плазмидный вектор, далее производится трансформация T. reesei. После встраивания целевой последовательности в ДНК, клетки T. reesei начинают вырабатывать яичный белок (наряду со своими собственными). Конечным продуктом клеточного производства является белковая смесь, которая подвергается разделению, ультрафильтрации, очистке и распылительной сушке для получения порошка биоальбумина.

Onego Bio выращивают клеточную культуру гриба в оптимальных условиях в биореакторе. В зависимости от стадии процесса добавляется глюкоза и питательные вещества; или культуру оставляют «голодать», чтобы выход продукта достиг максимально возможного уровня. В конце процесса биореактор заполняется биоальбумином, водой и биомассой T. reesei. Затем получившийся яичный белок отделяют от биомассы T. reesei и высушивают жидкость до состояния порошка. На рисунке 8 показана технологическая схема с этапами получения биоальбумина:

В светлом будущем Trichoderma reesei будет использоваться для переработки лигнина и целлюлозных материалов в качестве сырья, что позволит перерабатывать отходы деревообрабатывающей промышленности и использовать альтернативные виды углерода для получения человеческих продуктов питания.

Хотя компания утверждает, что Bioalbumen™ обладает той же функциональностью и вкусом, что и яичный белок, на данный момент биотехнологически полученный овальбумин не сможет заменить яйца, которыми все привыкли завтракать (овальбумин является не единственным компонентом в составе яичного белка; а полноценное яйцо помимо белка содержит также желток).

Глава 3. Мясо мамонта и как его готовить

Клеточное земледелие (cell agriculture) — это производство продуктов животного происхождения из клеточной культуры. В целом его можно разделить на три основных направления:

1. Культивирование биомассы для создания искусственного мяса, полученной с использованием методов тканевой инженерии. Используя эту технологию, живые клетки, взятые из биоптатов животных, вырастают в связанную структуру мяса.
2. Непосредственное выращивание одноклеточных организмов в пищу.
3. Использование прецизионной ферментации, при которой одноклеточные организмы не употребляются в пищу как таковые, а просто используются в качестве «живой фабрики», производящей желаемые белки, которые традиционно получали от животных.

Сегодня обычным мясом, полученным из растительных источников, уже никого не удивить. К примеру, продукция компании Beyond Meat получена из гороха, фасоли, картофеля или риса. Аналогично, компания Welldone производит мясные котлеты из бобовых культур с добавлением кокосового мяса (их можно купить и в России). Но есть и другой подход к культивированию мяса, используемый компанией Meatable, который заключается в выращивании плюрипотентных стволовых клеток крупного рогатого скота, их дифференцировке и последующем использовании для производства мясной продукции.

Культивирование мяса in vitro может осуществляться двумя способами: «самоорганизующимся» — использование эксплантантов («развитых» мышечных клеток, собранных у животных) [20] — и методом с использованием каркасов, при котором происходит дифференцировка и наращивание эмбриональных миобластов или стволовых клеток, фиксирующихся на каркасе (рис. 10) [21].

Первый метод подразумевает культивирование эксплантантов, полученных от сельскохозяйственных животных-доноров, с последующим выделением стволовых клеток, их рост, пролиферацию и дифференцировку в питательной среде под действием физических и химических стимуляторов. В процессе этого происходит формирование тканей, напоминающих по структуре, составу и органолептическим показателям обычное мясо за счет наличия в развитой мышце жировой ткани и системы кровообращения.

В рамках каркасного метода культивирования происходит размножение и фиксация стволовых клеток или эмбриональных миобластов на каркасах из коллагена или шариках микроносителя в питательной среде биореактора [21].

В настоящее время широко используются клетки-миосателлиты [20], отвечающие за восстановление тканей после незначительных повреждений и регенерацию мышц. В среде биореактора клетки выращиваются на каркасе, а затем сливаются вместе и дифференцируются в миобласты. В дальнейшем миобласты образуют мышечные миотрубочки, которые дифференцируются в миофибриллы. Миофибриллы извлекаются из каркаса и используются для формирования различных мясных продуктов [22].

Для производства культивированного мяса используются питательные среды, состоящие из 10–20% питательной среды и 0,5–2% эмбриональной телячьей/лошадиной сыворотки или экстракта куриных эмбрионов, способствующих эффективной дифференцировке клеток. Однако среды, получаемые из животных источников, имеют недостатки, такие как высокая стоимость, изменчивый состав и риск развития патогенов. Кроме того, использование сред, полученных из животных источников (например, фетальная бычья сыворотка), вызывает этические проблемы и делает полученное мясо непригодным для потребления веганами, вегетарианцами или по религиозным причинам [21].

Для решения данных проблем были разработаны бессывороточные среды, состоящие из растительных или синтетических соединений, которые способствуют росту и развитию клеток. Эти среды содержат все необходимые питательные вещества для пролиферации клеток: аминокислоты, витамины, гормоны роста, связывающие факторы, микроэлементы и другие питательные вещества. Примеры — растительные среды на основе экстракта гриба майтаке и бессывороточная среда Ultrasore G [20]. Однако стоит отметить, что питательные среды с растительными белками могут вызывать аллергические реакции у некоторых людей [21].

Для обеспечения оптимального роста клеток необходимо использовать подходящий каркас, который обеспечивает фиксацию миобластов на поверхности и их распространение в трехмерной структуре каркаса. В настоящее время основным материалом для создания клеточных каркасов являются гидрогели с пористой структурой. Это обусловлено их способностью обеспечивать эффективный доступ к клеткам необходимых питательных веществ и кислорода.

Идеальный каркас должен быть изготовлен из материала неживотного происхождения, иметь большую поверхность и обладать сходной жесткостью с тканями для правильного роста мышечных волокон. Каркас также должен обеспечивать надлежащую диффузию среды и легко отделяться от выращенного мяса. Часто для изготовления каркасов используются различные съедобные и несъедобные полимеры, такие как коллаген, целлюлоза и синтетические полимеры, например поли-L-молочная кислота [21].

Перспективы использования данной технологии не ограничиваются получением привычных для человечества мясных продуктов. Культивирование мяса также может быть использовано для создания уникальных продуктов, таких как котлета из мамонта — или, точнее, фрикадельки.

Основанный в 2019 году австралийский стартап Vow Food начинал с производства мяса, выращенного в лабораторных условиях из свинины и клеток кенгуру, и с тех пор расширил меню, включив в него кроликов, мышей, коз, буйволов и даже альпаку. В 2023 году Vow Food представил фрикадельку размером с дыню (рис. 11) из мяса мамонта в научном музее Nemo, чтобы обратить внимание СМИ на проблему животноводства и изменения климата.

Как известно, вымерший шерстистый мамонт стал символом утраты биоразнообразия нашей планеты [23]. Таким образом, целью создания фрикадельки являлась демонстрация потенциала производства мяса на основе клеток и привлечение внимания к технологиям, которые могут помочь в решении проблемы разрушения окружающей среды. Этот проект отличается от ранее объявленной инициативы американского исследователя и одного из основателей компании Colossal Biosciences Джорджа Черча, целью которого является возрождение мамонтов с использованием клеток слонов, глубокой заморозки и репродуктивной биологии [24].

Держу пари, это вкуснее, чем в Икее.

Культивированное в лаборатории мясо мамонта производилось подобно описанной выше технологии — путем поверхностного культивирования клеток животных до тех пор, пока они не образуют значительный агрегат ткани. Фрикадельки Vow's были выращены из клеток овец, в которые клонировали короткую последовательность ДНК миоглобина мамонта. Пробелы в последовательности «ископаемого» миоглобина заполняли, используя информацию из генома африканского слона — ближайшего из ныне живущих родственников вымершего животного. Ученые ввели синтезированный ген в мышечные стволовые клетки овцы, которые были выращены в лаборатории. После проведения трансфекции («вставки» последовательности в клетки) [25] отобрали только клетки, экспрессировавшие миоглобин мамонта на высоком уровне — для этого как маркер использовали синий флуоресцентный белок [26]: таким образом, каждая светящаяся синим клетка также продуцировала и «ископаемый» миоглобин. В итоге клетки продуцировали гигантскую версию миоглобина — гемового белка, содержащегося преимущественно в клетках мышц позвоночных животных и выполняющего важные функции в оксигенации тканей. Миоглобин также является важным источником биодоступного железа и ответственен за цвет получаемого мяса, придавая также мышцам всем известный мясной вкус [27].

Сложной задачей стало вырастить достаточное количество клеток для создания целой фрикадельки (более 20 миллиардов клеток). Тут нужно было разработать метод поверхностного выращивания клеток в крупных масштабах вместо традиционного культивирования в промышленных биореакторах. Это связано с тем, что клетки, использованные для создания гигантской фрикадельки, могли формировать агрегаты только при выращивании с использованием многослойных «фабрик клеток», для чего потребовалась площадь почти 100 м², что соответствует размерам небольшого ресторана.

К сожалению, поскольку полученная фрикаделька содержит белки, которые не употреблялись в пищу человеком уже тысячи лет, ученые не уверены, что полученное мясо мамонта есть безопасно. Как жаль, что это оказался просто маркетинговый ход, придуманный креативным агентством Vow.

Однако яичного белка и мяса недостаточно для полноценного завтрака. В таком случае, добро пожаловать в мир овощей.

Глава 4. Томаты чили

Капсаициноиды — это вторичные метаболиты (соединения группы алкалоидов), содержащиеся в различных видах стручкового чили перца Capsicum, которые отвечают за остроту перца. Основными представителями группы являются капсаицин и дигидрокапсаицин (рис. 12).

Эти вторичные метаболиты образуются в результате сложных биохимических каскадов реакций, в том числе синтеза фенилпропаноидов и жирных кислот (рис. 13). Капсаициноиды, продуцируемые в остром перце в различных количествах, обладают антиоксидантными, противовоспалительными и противоопухолевыми свойствами. Также в плодах стручкового перца содержится большое количество витаминов А и С и флавоноидов. Таким образом, регулярное потребление капсаициноидов полезно для здоровья человека и, следовательно, чили перец можно отнести к функциональным продуктам питания. Интересно, что из всех овощей только плоды стручкового перца содержат эти полезные соединения [29].

Феномен ощущения боли и жжения во рту при употреблении жгучего перца находит объяснение в функционировании рецептора TRPV1. Относящийся к семейству неселективных ионных каналов TRP [30], он отвечает за детекцию и регуляцию температуры организма, а также за восприятие острой боли. Влияние капсаицина — высокоселективного и мощного экзогенного агониста рецептора TRPV1 — приводит к его активации и пропусканию ионов кальция (Ca²⁺); аналогичное действие оказывает температура выше 43°C [31]: в этот момент мы ощущаем острую боль. За исследование структуры и механизмов работы TRP-рецепторов в 2021 году была вручена Нобелевская премия [32].

Именно способность капсаицина воздействовать на рецептор TRPV1 позволяет использовать его в качестве местного обезболивающего средства совместно с анестетиком QX–314 (производным лидокаина) [30].

Забавный факт: семена острого перца менее подвержены заражению грибком Fusarium, поэтому особи с более острыми плодами размножаются эффективнее, чем с менее острыми. Вероятно, данная адаптация была изначальной функцией капсаициноидов, направленной на отпугивание млекопитающих и защиту от грибков, а естественный отбор привел к появлению более острых видов стручкового перца.

Геномы стручкового перца и томата обладают одинаковым базовым числом хромосом (12); а их морфологические и физиологические процессы завязывания плодов аналогичны. Известно, что урожайность острого перца не превышает 3 тонн с гектара за 4–5 месяцев выращивания, в то время как у томатов может достигать 110 т/га на поле в течение 120-дневного цикла посева. Таким образом, использование помидоров в качестве «биофабрики» для синтеза капсаициноидов — удачная идея для получения этих вторичных метаболитов.

Сравнение геномов стручкового перца и томата выявило в последнем все необходимые гены для выработки капсаициноидов; однако в сравнении с перцем чили, томаты слабее экспрессируют гены PAL (фенилаланин аммония-лиазы), C4H (кверцетин 3-гидроксилазы), ACL (белка-переносчика ацила) и AMT (аминотрансферазы). Кроме того, гены COMT (кофеоил-КоА 3-О-метилтрансферазы) и FaTA (ацил-ACP тиоэстеразы) проявляют временно ограниченную низкую экспрессию. А также два гена — BCAT (аминотрансферазы аминокислот с разветвленной цепью) и CS (цитратсинтазы) — не экспрессируются вообще [29].

Ученые из Бразилии и Ирландии использовали генетические технологии TALEN и CRISPR/Cas9 для создания первого помидора, обладающего естественной остротой, внеся в него недостающие для пикантного вкуса гены.

Для создания острых помидоров может быть использована комбинация двух генно-инженерных подходов для активации биосинтеза капсаициноидов (рис. 14). Одним из них является использование эффекторов, подобных активаторам транскрипции (TALEs) [8] — набора белков, которые позволяют мультиплексировать активацию до четырех генов у растений. С использованием системы рекомбинации MultiSite Gateway возможно осуществить быструю сборку повторов TALE в единый вектор ДНК-переноса — Т-ДНК (transferred DNA, участок Ti-плазмиды) [33], что позволило повысить экспрессию PAL, KAS, COMT и FaTA. Однако требуется определить, достаточны ли достигнутые уровни транскрипции для работы капсаициноидного пути, поскольку экспрессия может быть как недостаточной, так и избыточной, что может привести к сайленсингу гена [29].

Вторая стратегия включает в себя использование генной инженерии для целенаправленной замены промоторных областей генов. Метод предполагает вставку промоторной последовательности «вверх» от целевого гена. Данный метод был продемонстрирован на примере томатов с использованием конститутивного промотора 35S, вставленного перед геном ANT1, который кодирует транскрипционный фактор R2R3-MYB (CaMYB31), положительно регулирующий транскрипцию нескольких ключевых генов биосинтеза капсаициноидов (C4H, COMT, Kas и AMT). Промоторные области неактивных генов капсаициноидного пути (BCAT, CS) могут быть заменены эндогенными промоторами, специфичными для плодов томата, такими как E8, для создания растений с транскрипционно активными генами. Однако требуется дальнейшее исследование, чтобы определить, полностью ли функциональны белки этих генов, и активно ли они катализируют соответствующие биохимические реакции [29].

С нетерпением ожидаю момента, когда мы сможем приготовить пикантную сальсу из гибридных сортов томата и чили. ¡Buen provecho! 

Становится жарковато, поэтому настало время охладиться и взять из холодильника яблоко со вкусом дыни.

Глава 5. Арбузная вишня или лимонное яблоко?

Усовершенствование и выведение новых сортов растений — это игра вдолгую, требующая терпения и настойчивости со стороны селекционеров. Им могут потребоваться годы или даже десятилетия, чтобы создать новые сорта фруктов и овощей, обладающие лучшим вкусом, более быстрой скоростью роста или продолжительным сроком годности и свежести. Однако их работа приобретает особую актуальность в свете все более нестабильного климата и увеличивающихся потребностей населения в пище [34]. Создание новых культур, способных процветать в таких условиях и удовлетворять требования покупателей, и есть решение.

Стартап Pairwise, базирующийся в Северной Каролине (США), использует технологию редактирования генов CRISPR/Cas и секвенирование нового поколения для создания и вывод на рынок фруктов и овощей с улучшенным вкусом, увеличенным сроком хранения, повышенной урожайностью и с более длительным периодом вегетации.

Листья горчицы — первый продукт питания, разработанный Pairwise с использованием технологии CRISPR/Cas, — уже доступен в продуктовых магазинах США под маркой Conscious Greens. Зеленые листовые овощи, такие как шпинат, капуста и зелень горчицы, являются богатым источником витаминов, минералов, фенольных соединений и других питательных веществ, таких как кальций и железо. В салатах и других блюдах часто используется свежая листовая зелень, особенно салат-латук. Однако салат-латук не обладает такой высокой питательной ценностью, как некоторые другие виды зелени [35].

Среди различных видов листовой зелени горчичная зелень (Brassica juncea) отличается большим разнообразием внутривидовых характеристик, таких как цвет, размер и текстура листьев. При пережевывании листьев горчицы образуются аллилизотиоцианаты — соединения, которые придают ей остроту и вовлечены в защитный механизм против травоядных животных. При разрушении растительных клеток происходит высвобождение двух молекул: фермента мирозиназы и предшественника глюкозинолата. Смешиваясь, они образуют аллилизотиоцианат — соединение, также присутствующее в других острых растениях, таких как хрен. Этот эффект, известный как «горчичная бомба» (рис. 16А), может быть неприятным для некоторых потребителей. Поэтому горчичная зелень либо употребляется в небольших количествах, либо подвергается тепловой обработке (фермент мирозиназа распадается, предотвращая появление горечи в листьях горчицы), что может снизить содержание некоторых питательных веществ, таких как фолиевая кислота и лютеин [35].

Компания Pairwise решила сделать листья горчицы более привлекательными для потребителей, подавив реакцию «горчичной бомбы» и получив листовую зелень с пониженной остротой. Чтобы имитировать эффект приготовления и предотвратить взаимодействие молекул, которое вызывает горечь, команда Pairwise использовала генное редактирование для «отключения» гена мирозиназы. Удаление этого гена потребовало относительно простой процедуры: сдвига рамки считывания в кодирующей последовательности, что привело к потере функции фермента.

Но создание растения было далеко не простой задачей. Основная сложность заключалась в том, что горчица тетраплоидна, что означает наличие нескольких копий гена, которые нужно изменить одновременно, чтобы получить желаемый эффект. Используя геноспецифический мутагенез с помощью CRISPR/Cas12a, Pairwise получили растения с нокаутами всех функциональных 17 копий мультигенного семейства мирозиназ I типа у тетраплоидной Brassica juncea. Проведенные тепличные и полевые испытания в различных условиях показали, что эти растения не имеют резкого запаха, — с помощью биохимических и сенсорных анализов [35].

В итоге листья изменили форму, а также приобрели приятный аромат: их вкус сравним с листьями салата, а структура очень напоминает листья салата-латука (рис. 16Б). Важно отметить, что технически полученная зелень горчицы не является генетически модифицированным организмом (ГМО). В геном не встраивается чужеродный ген, а значит — не происходит синтез чужеродного белка [36]. В США продукты, подвергнутые генетическому редактированию, не подпадают под те же нормы и правила, что и ГМО, поскольку их генетические изменения могут быть результатом традиционной селекции, такой как удаление гена или замена определенных нуклеотидов ДНК. В результате генно-редактированные продукты не требуют обязательной маркировки. В отличие от этого, ГМО должны быть явно помечены как «биоинженерные» или «полученные путем биоинженерии» в соответствии с новыми федеральными требованиями, которые вступили в силу в начале 2022 года. О результатах одного из исследований пользы и вреда (которого не нашли) ГМО-продуктов можно прочесть в статье «ГМО: бояться нельзя питаться. Биологи знают, где поставить запятую!» [37].

Помимо горчицы, компания также пытается улучшать фрукты. Следующим прорывом (в сотр. с Университетом Штата Северной Каролины), как надеются исследователи Pairwise, станет ежевика без косточек, которая растет на компактных лозах и требует меньше земли, воды и удобрений. А что после этого?

Мы разрабатываем вишню без косточек. Цель Pairwise — сделать и без того здоровую пищу более удобной и приятной.

Недавно компания Pairwise была отмечена за свою революционную работу в области разработки новых культурных растений, способных эффективно противодействовать проблемам, связанным с изменением климата. The New York Times от 25 сентября 2023 г. признал Pairwise одной из ведущих компаний, находящихся в авангарде сферы создания овощей и фруктов будущего [38].

Желание опробовать яблоко с дынным вкусом осталось неудовлетворенным. Однако, возможно, стартап Cocuus обладает потенциалом реализовать данную фантазию?

Глава 6. Напечатаешь мне киви?

Испанский стартап Cocuus использует 3D-биопечать для производства продуктов питания и стремится масштабировать свою бизнес-модель и выйти на международный рынок. Компания является лидером в разработке промышленных решений для производства аналогов миметических пищевых продуктов (от англ. mimetic food — то есть продуктов, имитирующих реальные блюда) из растительного или клеточного животного белка с использованием 3D-экструзионной печати, биопечати и робототехники.

Пищевой 3D-принтер оперирует на основе принципа экструзионной печати, позволяющего выдавливать и приклеивать расплавленные или пастообразные материалы к предыдущему слою сырья, тем самым создавая продукт слой за слоем. Однако при использовании экструзии для печати пищевых продуктов возникают определенные сложности, такие как разработка биочернил с определенными свойствами, подбор параметров печати и последующая обработка полученной продукции.

Белок является неотъемлемым полимерным соединением для печати, состоящим из аминокислот. «Чернила» для 3D-печати на основе белка (растительного или животного происхождения) предполагают широкий спектр применений и могут быть использованы для создания разнообразных форм. При 3D-печати пищевых продуктов с применением экструзии, реологические свойства (деформируемость, текучесть) биочернил играют ключевую роль. Краска должна легко выдавливаться через сопло, но быть достаточно прочной, чтобы сохранять форму продукта [39].

Cocuus занимается разработкой продуктов питания в четырех основных направлениях (рис. 17):

• MEATBASED — создание стейков и других мясных продуктов с использованием диссоциированных клеток, полученных из мяса, а также технологии повторного использования мяса в промышленности;
• PLANTBASED — производство новых веганских аналогов традиционных продуктов и разработка соответствующих технологий;
• CELLBASED — исследование новых методов промышленного культивирования клеток in vitro; и
• SOFTMIMIC — улучшение процессов создания пищевых продуктов из пюре, которые имеют сходство с настоящей пищей.

Компания прибегла к технологии SOFTMIMIC в рамках проекта NUTRI+, нацеленного на улучшение качества жизни людей, страдающих дисфагией. Совместно с National Center for Food Technology они разработали рецептуры пюре, которые по своему вкусу и внешнему виду напоминают традиционные блюда, однако при надавливании ведут себя как обычное пюре. Это позволило компании расширить ассортимент меню для людей с дисфагией и предложить им продукты с интересным вкусом и текстурой. К примеру, была создана имитация курицы и гороха, которые не только выглядят и вкусны, как обычные продукты, но и легко проглатываются людьми, страдающими дисфагией.

Cocuus разработали прототипы стейков, бекона, креветок и лосося (рис. 18) с использованием своей платформы Mimethica, которая объединяет в себе 3D-печать и специально разработанные «краски» для придания блюдам текстуры и цвета, делая их фотореалистичными.

Белок является ключевым компонентом биочернил, поскольку его структура и pH раствора оказывают существенное влияние на пригодность для печати. Желатин, полученный из коллагеновых волокон, является популярным материалом для 3D-печати благодаря своей текстуре и гелеобразным свойствам. Кроме того, для достижения сбалансированного аминокислотного профиля в печатных продуктах можно использовать комбинацию различных источников растительного белка, таких как соя и горох. Смеси соевого белка и желатина также могут быть использованы для создания стабильных и точных геометрических форм. Добавление горохового белка, например, может улучшить структуру и стабильность продукта, а также придать ему вкус жира [39].

В 2018 году компания Cocuus представила два инновационных продукта: лазерный принтер LASERGLOW и струйный принтер LEVEL-UP. LASERGLOW является 2D и 3D лазерным принтером, способным изменять форму и маркировать продукты питания, создавая 3D-оттиски. Принтер может использоваться на всех видах твердой пищи, включая мясо, рыбу и овощи.Одним из главных преимуществ LASERGLOW является его высокая скорость перемещения (до 200 мм/с), достигаемая за счет использования лазера вместо пластикового экструдера, применяемого другими производителями. Таким образом, принтер создает объекты, придавая форму твердому пищевому продукту, — вместо его добавления как экструдер.

Другой продукт компании Cocuus — струйный принтер LEVEL-UP, предназначенный для 2D-дизайна, такого как нанесение логотипов. Принтер может наносить логотипы на жидкости с пеной, такие как пиво и кофе в стакане или чашке. Разработка LEVEL-UP заняла полтора года, и он был выпущен на рынок в конце 2018 года. Преимущество этого продукта заключается в возможности компаний наносить свои логотипы на продукты питания или напитки, что позволяет им уникальным и запоминающимся способом рекламировать себя.

В настоящее время Cocuus сосредоточена на разработке трехмерной структуры коллагена и гиалуроновой кислоты, создающих удобную среду для размножения стволовых клеток. Это предлагает первое масштабируемое решение для культивирования клеток мяса и рыбы in vitro, которое также можно применить к клеткам растений.

Компания Cocuus нацелена на достижение лидерства в сфере растительных альтернатив мясным и рыбным продуктам, применяя передовые технологии пищевой печати. В настоящее время предприятие способно производить 250 килограммов бекона на растительной основе в час с помощью одного принтера для биопечати. Однако компания стремится расширить свою производственную мощность и перейти на второй этап, на котором будет осуществляться масштабное производство веганского тунца и креветок.

Глава 7. Еда из воздуха

Финский биотехнологический стартап Solar Foods, основанный в 2017 году, трудится над разработкой нового продукта, который представит альтернативу животным белкам на рынке. Этот продукт, названный Solein (солеин), получают из воздуха — как утверждает компания, — но на самом деле производится с помощью микробиологической ферментации.

Для производства солеина нужны всего несколько «ингредиентов»: культура микроорганизмов (штамм VTT-E-193585, обнаруженный одним из основателей компании в близлежащем лесу в Финляндии), воздух, вода и электричество. В биореакторе происходит расщепление воды на кислород и водород с использованием электричества. Полученный водород затем добавляется к углекислому газу и подается микроорганизмам для ферментации, а также кальций, фосфор, азот и калий. С использованием этой технологии получается протеиновый порошок, макронутриентный состав которого очень похож на состав сушеной сои или водорослей (например, спирулины). Он содержит 65–70% белка (включая девять незаменимых аминокислот), 5–8% жира, 10–15% пищевых волокон и 3–5% минеральных питательных веществ, таких как железо, а также витамины группы B. Очищенная форма солеина, полученная после процесса ферментации в биореакторах и стадии сушки, представляет собой желтый порошок и обладает нежным уникальным вкусом, напоминающим вкус белых грибов с приятной ноткой умами (рис. 19).

Данная технология предлагает уникальный подход к получению белка, исключая необходимость использования сельскохозяйственных ферм, занимающих большие площади земли. Таким образом, солеин может производиться на заводах, расположенных в отдаленных районах или внутри городов. Компания Solar Foods уже получила разрешение на строительство своего первого производственного объекта, Factory 01 в Вантаа (Финляндия) и планирует завершить его к 2024 году. Это позволит Solar Foods начать масштабирование производства солеина и коммерциализировать его продажу.

Изначально компания Solar Foods занималась разработкой технологии газовой ферментации для выращивания солеина в космических условиях и использования его в качестве пищевой добавки для астронавтов. Компания стала одним из победителей первого этапа конкурса Deep Space Food Challenge, проводимого NASA и CSA. В настоящее время Solar Foods разрабатывает портативный биореактор, который сможет производить солеин в космических условиях для миссии NASA «Артемида» и будущих миссий на Марс. Это позволит астронавтам на орбите насладиться кремовой версией солеина в качестве мороженого с ароматом лайма — вместо традиционного сублимированного мороженого [40].

Пока неизвестно, каким будет первый продукт для потребителей, содержащий солеин. Возможны варианты добавления его в уже существующие продукты, такие как сухие завтраки, мороженое, йогурт, веганские блюда, или использование его в продуктах, заменяющих мясо на растительной основе. Также солеин можно использовать в качестве заменителя яиц при производстве макаронных и кондитерских изделий из теста. Solar Foods не планируют самостоятельно производить продукты питания, но на их веб-сайте можно увидеть изображения демонстрационных продуктов, таких как кусочки курицы с макаронами, супы, хлеб и смузи (рис. 20).

Производители продуктов питания по всему миру стремятся найти пути для внесения своего вклада в достижение климатических целей, таких как сокращение глобального потепления до 1,5 ℃ (согласно Парижскому соглашению 2016 года). Лесное хозяйство отвечает за не менее чем 24% всех выбросов парниковых газов [41], поэтому поиск более устойчивых методов производства белка и других продуктов питания является ключевым фактором для достижения этих целей. В этом отношении Solar Foods занимает лидирующую позицию.

Наша цель не заключается в полном замещении сельского хозяйства. Мы стремимся предоставить земле возможность восстановиться, заменяя ресурсоемкие продукты на те, производство которых не требует больших затрат. В будущем мы видим сосуществование ферм и биотехнологических производств с биореакторами. Компания работает над получением статуса GRAS (общепризнанный как безопасный), чтобы ее продукты, произведенные из солеина, могли появиться на полках магазинов в США к 2024 году.

Одно ясно — будущие продукты питания не будут скучными и однообразными. Производство белка без использования традиционного сельского хозяйства могло бы изменить наш ежедневный рацион и помочь людям выживать в космосе и в будущих планетарных колониях.

Глава 8. Самый инновационный завтрак готов. А что будет дальше?

На этом все, мы собрали почти идеальный завтрак — правда, хлеба не хватает. Но генно-инженерного хлеба пока не придумали, кроме полученного из ГМО-сортов зерновых культур, например от компании Bioceres-Indear.

Однако будущее фудтеха уже стоит на пороге, и невозможно объять все инновации в этой сфере; поэтому стартап MYCO Technology по получению белка с помощью грибов и стартапы, разрабатывающие альтернативные приемы пищи — Digital Meal и Soylent, — я оставляю вам на домашнее задание.

Приятного аппетита!

Литература

1. François Ruf, Götz Schroth, Kone Doffangui. (2015). Climate change, cocoa migrations and deforestation in West Africa: What does the past tell us about the future?. Sustain Sci. 10, 101-111;
2. Pearce F. (2019). The Real Price of a Chocolate Bar: West Africa’s Rainforests. Yale Environment 360;
3. W. Vervuurt, M. A. Slingerland, A. A. Pronk, L. G. J. Van Bussel. (2022). Modelling greenhouse gas emissions of cacao production in the Republic of Côte d’Ivoire. Agroforest Syst. 96, 417-434;
4. Carolin Franziska Reichert, Tom Deboer, Hans‐Peter Landolt. (2022). Adenosine, caffeine, and sleep–wake regulation: state of the science and perspectives. Journal of Sleep Research. 31;
5. Caroline Y. Um, Marjorie L. McCullough, Mark A. Guinter, Peter T. Campbell, Eric J. Jacobs, Susan M. Gapstur. (2020). Coffee consumption and risk of colorectal cancer in the Cancer Prevention Study-II Nutrition Cohort. Cancer Epidemiology. 67, 101730;
6. Обо всех РНК на свете, больших и малых;
7. Просто о сложном: CRISPR/Cas;
8. 12 методов в картинках: генная инженерия. Часть II: инструменты и техники;
9. E.D.N.S. Abeyrathne, H.Y. Lee, D.U. Ahn. (2013). Egg white proteins and their potential use in food processing or as nutraceutical and pharmaceutical agents—A review. Poultry Science. 92, 3292-3299;
10. Eleana Sarantidi, Alexandra Ainatzoglou, Christine Papadimitriou, Eleni Stamoula, Katerina Maghiorou, et. al.. (2023). Egg White and Yolk Protein Atlas: New Protein Insights of a Global Landmark Food. Foods. 12, 3470;
11. Stadelman W.J., Newkirk D. & Newby L. Egg Science and Technology (4th Edition). FL: CRC Press, 2017. — 608 p.;
12. Helle R. Juul-Madsen, Birgit Viertlböeck, Sonja Härtle, Adrian L. Smith, Thomas W. Göbel. (2014). Innate Immune Responses. Avian Immunology. 121-147;
13. Jaakko Hiidenhovi, Heikki S. Aro, Veikko Kankare. (1999). Separation of Ovomucin Subunits by Gel Filtration:  Enhanced Resolution of Subunits by Using a Dual-Column System. J. Agric. Food Chem.. 47, 1004-1008;
14. Natasha Järviö, Tuure Parviainen, Netta-Leena Maljanen, Yumi Kobayashi, Lauri Kujanpää, et. al.. (2021). Ovalbumin production using Trichoderma reesei culture and low-carbon energy could mitigate the environmental impacts of chicken-egg-derived ovalbumin. Nat Food. 2, 1005-1013;
15. Kong F Chai, Kuan R Ng, Malsha Samarasiri, Wei N Chen. (2022). Precision fermentation to advance fungal food fermentations. Current Opinion in Food Science. 47, 100881;
16. 12 методов в картинках: секвенирование нуклеиновых кислот;
17. Молекулярное клонирование, или как засунуть в клетку чужеродный генетический материал;
18. Факты и легенды о мультиомиксных технологиях;
19. Hana Žáková, Jiří Pazderka, Zuzana Rácová, Pavla Ryparová. (2019). Effect of bacteria Bacillus pseudofirmus and fungus Trichoderma reesei on self-healing ability of concrete. APP. 21, 42-45;
20. Культивируемое мясо — продукт завтрашнего дня;
21. Pavan Kumar, Neelesh Sharma, Shubham Sharma, Nitin Mehta, Akhilesh Kumar Verma, et. al.. (2021). In-vitro meat: a promising solution for sustainability of meat sector. J Anim Sci Technol. 63, 693-724;
22. Shruti Sharma, Sukhcharanjit Singh Thind, Amarjeet Kaur. (2015). In vitro meat production system: why and how?. J Food Sci Technol. 52, 7599-7607;
23. Это страшное слово «дефаунизация»;
24. Криобиология: как остановить биологические часы и запустить их обратно;
25. Tae Kyung Kim, James H. Eberwine. (2010). Mammalian cell transfection: the present and the future. Anal Bioanal Chem. 397, 3173-3178;
26. Флуоресцентные репортеры и их молекулярные репортажи;
27. Surendranath P. Suman, Poulson Joseph. (2013). Myoglobin Chemistry and Meat Color. Annu. Rev. Food Sci. Technol.. 4, 79-99;
28. Jing Xia, Li Gu, Yitong Guo, Hongyan Feng, Shuhan Chen, et. al.. (2021). Gut Microbiota Mediates the Preventive Effects of Dietary Capsaicin Against Depression-Like Behavior Induced by Lipopolysaccharide in Mice. Front. Cell. Infect. Microbiol.. 11;
29. Emmanuel Rezende Naves, Lucas de Ávila Silva, Ronan Sulpice, Wagner L. Araújo, Adriano Nunes-Nesi, et. al.. (2019). Capsaicinoids: Pungency beyond Capsicum. Trends in Plant Science. 24, 109-120;
30. Жгучий перец облегчит боль;
31. P. Anand, K. Bley. (2011). Topical capsaicin for pain management: therapeutic potential and mechanisms of action of the new high-concentration capsaicin 8% patch. British Journal of Anaesthesia. 107, 490-502;
32. Трогательная и жгучая — за что вручили Нобелевскую премию по медицине (2021);
33. Еще раз про ГМО;
34. Daniel Jenkins, Nicole Juba, Brian Crawford, Margaret Worthington, Aaron Hummel. (2023). Regulation of plants developed through new breeding techniques must ensure societal benefits. Nat. Plants. 9, 679-684;
35. Dale Karlson, Julius P. Mojica, Thomas J. Poorten, Shai J. Lawit, Sathya Jali, et. al.. (2022). Targeted Mutagenesis of the Multicopy Myrosinase Gene Family in Allotetraploid Brassica juncea Reduces Pungency in Fresh Leaves across Environments. Plants. 11, 2494;
36. От ГМО к растениям будущего. Всё самое интересное о сложной работе современного селекционера;
37. ГМО: бояться нельзя питаться. Биологи знают, где поставить запятую!;
38. Severson K. (2023). Meet the Climate-Defying Fruits and Vegetables in Your Future. The New York Times;
39. Ziang Guo, Muhammad Arslan, Zhihua Li, Shaoyi Cen, Jiyong Shi, et. al.. (2022). Application of Protein in Extrusion-Based 3D Food Printing: Current Status and Prospectus. Foods. 11, 1902;
40. Adler T. (2023). Will Space-Age Protein Powder Change the Future of Food?. Vogue;
41. Global Greenhouse Gas Emissions Data. (2023). United States Environmental Protection Agency.