Конкурс «Био/Мол/Текст»-2020/2021

Эта работа опубликована в номинации «Свободная тема» конкурса «Био/Мол/Текст»-2020/2021.

---

Генеральный партнер конкурса — ежегодная биотехнологическая конференция BiotechClub, организованная международной инновационной биотехнологической компанией BIOCAD.

---

Спонсор конкурса — компания SkyGen: передовой дистрибьютор продукции для life science на российском рынке.

---

Спонсор конкурса — компания «Диаэм»: крупнейший поставщик оборудования, реагентов и расходных материалов для биологических исследований и производств.

---

«Книжный» спонсор конкурса — «Альпина нон-фикшн»

Произведениям искусства угрожают не только вандалы, воры, сырость и пыль. Столкновение с чем угодно из этого неизбежно приводит к заселению арт-объекта бактериями и микроскопическими грибами, расселительные формы которых путешествуют с капельками влаги, пылинками, а также людьми и животными. Казалось бы, что в этом плохого? Но некоторые из этих «поселенцев» приводят к разрушению предметов искусства: появлению цветных пятен, разрушению бумаги, холста или краски и т.д.

По этой причине некоторые произведения в наши дни реставрируют в комнатах, которые больше напоминают химические или биологические лаборатории. Специалисты стремятся минимизировать риск, связанный с влиянием факторов живой и неживой природы, но не всегда есть возможность обеспечить объектам культурного наследия должные условия содержания: например, при транспортировке, кражах и самой реставрации. Поэтому за прошлые десятилетия, или даже столетия, несмотря на стремление сохранить произведения искусства, некоторым из них уже был нанесен серьезный ущерб.

Благодаря развитию технологий у нас есть не только шанс восстановить или защитить предметы культурного наследия, но и выяснить причину их повреждений, например, связанную с развитием микробных сообществ на их поверхности. Как оказалось, это также позволяет пролить свет на историю полотен, фресок и рисунков, хранящихся в музеях мира и частных коллекциях.

В статье австро-итальянского коллектива [1] описано метагеномное исследование рисунков Леонардо нашего да Винчи. Авторы демонстрируют применение относительно нового неинвазивного метода сбора образцов, а также секвенирования третьего поколения и сканирующей электронной микроскопии для комплексного изучения экспонатов. Предлагаю читателям «Биомолекулы» взглянуть на мир искусства через призму современных методов молекулярной биологии. А тем, кто интересуется практическим применением фундаментальной науки, — да, господа, не только биомедицина и криминалистика.

Немного истории

Что же нового предложили Гваделупе Пиньяр [1] и ее коллеги? На протяжении последних 20 лет самыми распространенными методами оценки состояния полотен и отслеживания состава колонизирующих организмов были [2]:

• ДНК-дактилоскопия (DNA-fingerprinting), или определение уникальных особенностей ДНК для идентификации организма [3]. Сейчас чаще STR-анализ, или микросателлитный анализ. Микросателлиты, или STR(short tandem repeat, короткие тандемные повторы), — это короткие повторы некодирующей ДНК [4]. Отбор против них не действует, так как они не влияют на приспособленность организма, поэтому STR не элиминируются и характеризуются достаточно высокой вариабельностью — их можно использовать как «отпечаток пальца» какого-либо вида или даже индивида.
• Секвенирование по Сэнгеру. «Золотой стандарт», не очень производительный (короткие прочтения до 1000 bp), но достаточно точный и недорогой метод. Такие небольшие участки ДНК, как рибосомные гены или микросателлиты, им как раз удобно секвенировать. Подробнее об этом и других методах секвенирования можно прочитать на «Биомолекуле» [5].
• Физико-химический анализ. Еще с 20-х годов ХХ века методы спектроскопии стали применять не только в фундаментальных исследованиях, но и для решения практических задач, например, в реставрации. Атомно-эмиссионная спектроскопия, впервые использованная в сфере искусства почти 100 лет назад для определения подлинности картин Ренуара, все еще является одним из ходовых методов наряду с более современными, такими как инфракрасная спектроскопия и масс-спектрометрия [6]. Все это позволяет определять химический состав и возраст произведений искусства. Каждый из методов показывает себя лучше в определении минеральных или органических компонентов, незначительных примесей и т.д.
• Микроскопия [7]. В случае с оптической микроскопией, хотя это также физический метод исследования, стоит упомянуть ее отдельным пунктом, так как она не сможет дать представление о химическом составе пигментов или основы арт-объекта. Но есть все же вид микроскопии, который поможет убить сразу двух зайцев — это сканирующая электронная микроскопия (СЭМ). Как именно она позволяет разглядеть рельеф поверхности и ее химический состав одновременно, будет сказано чуть позднее.

Стоит сказать, что описанные в этом разделе методы доступны не всем музеям и применяются не к каждому произведению. Но даже в случае с такими ценными и всемирно известными работами, как полотна и этюды Леонардо, посидеть над ними с бинокуляром и иголочкой все равно придется.

Мы пойдем другим путем

На смену «Сэнгеру» пришли методы NGS (Next Generation Sequencing, секвенирование следующего поколения), что помогло развитию метагеномики и изучению реальных сообществ микроорганизмов [5]. Используя разные модификации этих методов, исследователь может производить как полногеномное, так и таргетное секвенирование (расшифровку определенных участков ДНК), изучать транскрипцию, степень метилирования и ДНК-белковые взаимодействия. Но главное преимущество NGS для таких исследований, как обсуждаемое в настоящей статье — возможность анализа геномов всех представителей какого-либо домена жизни, которые попали в пробирку после сбора образцов, или метагеномного анализа. На холстах и пергаменте обычно не так-то много ДНК, она не всегда в хорошем состоянии, а все эти методы основаны на предварительной ПЦР-амплификации (умножении) считываемой последовательности [8]. Для последней нужен праймер — затравка для начала реакции, которая должна быть комплементарна началу копируемой последовательности. В данном случае можно использовать вырожденные праймеры , если известна аминокислотная последовательность какого-то из белков интересующего организма. Также есть возможность амплифицировать ДНК таргетно, используя какие-то консервативные последовательности, например, гены рРНК. Последний вариант, который чаще используется на практике, предполагает, что можно оценить разнообразие, условно, всех бактерий на этом куске искусства, но за раз сделать выводы о представителях трех доменов жизни не выйдет, потому что эукариоты и археи будут различаться как раз такими консервативными участками.

Вырожденные праймеры — это смесь большого количества праймеров для ПЦР, кодирующих одну и ту же аминокислотную последовательность, но отличающихся нуклеотидами в нескольких позициях. Одна аминокислота может кодироваться несколькими вариантами триплетов, например, цистеин (АЦА или АЦГ) — значит, какой-то из вариантов да подойдет.

Поэтому авторы еще в предыдущей статье [9] использовали сочетание секвенирования третьего поколения (иногда эти методы отделяют от NGS), а именно MinION от Oxford Nanopore, и полногеномной амплификации (копирования всей собранной последовательности ДНК). Главными аргументами в пользу такого подхода стали:

• длинные прочтения (табл.1);
• не обязательная промежуточная наработка продукта (спойлер: здесь была обязательна);
• отсутствие необходимости химической маркировки;
• компактность устройства (правда, не всех машин для нанопорового секвенирования, а только MinION).

Красота, одним словом. Но кое-какой недостаток метода авторы не упомянули — низкая точность. Если посмотреть на параметр QS (quality score, или дословно «показатель качества»), можно заметить, что все значения колеблются около 10 (табл. 1). Это означает, что вероятность того, что нуклеотид был определен ошибочно, равна примерно 1/10. Для QS = 30 эта вероятность 1/1000, для 60 — 1/1000000 и т.д.

Возможно, в метагеномном исследовании это не имеет такого значения, как при сборке геномов de novo. Цель таких исследований в том, чтобы определить присутствующие в образце таксономические группы и получить комплексное представление о биоме исследуемого объекта. В метагеномике ученые используют понятие OTU (Operable taxonomic unit), что можно перевести, как «значимая таксономическая единица» — та, которой можно оперировать. Иногда она эквивалентна типу или классу, а в некоторых случаях удается определить род или даже вид организма, которому принадлежит ДНК.

Таксономическая группа — единица биологической систематики. По современным представлениям для таксономических групп должна быть характерна монофилия, то есть происхождение всех представителей таксона от общего предка.

Для сбора образцов исследователи использовали вакуумную трубку со стерильным сменным наконечником, в котором находился фильтр из нитроцеллюлозы. Сначала ученые находили подозрительные места с помощью бинокуляра, затем собирали образцы, причем старались с каждой выбранной точки взять достаточное количество материала не только для микроскопии, но и для метагеномного анализа. «Подозрительность» точки сбора часто была вызвана цветными пятнами или неясного на тот момент происхождения «инкрустациями» в бумаге.

Сканирующая электронная микрокопия (СЭМ) и элементный анализ (EDS)

С помощью СЭМ можно не только разглядеть мицелий, споры и бактерий, но и выяснить химический состав поверхности. Чтобы получить потрясающие изображения микроскопических рельефов (рис. 2), нужно направить на препарат пучок электронов. После взаимодействия с атомами исследуемого образца часть электронов пройдет насквозь, другие будут отражены, и для их улавливания существует детектор — BSD (backscattered electron detector). В зависимости от режима, этот детектор может использоваться для разных целей, но в данной работе отраженные электроны предоставили информацию о топологии: количество электронов, которые попадут в детектор, будет зависеть от угла между пучком электронов от установки и поверхностью препарата, а также от расположения детектора.

А для элементного анализа авторы обсуждаемого исследования использовали энергодисперсионную рентгеновскую спектроскопию (EDS, или EDX), принцип работы которой основан на явлении испускания атомом характерного именно для него рентгеновского излучения после перехода в возбужденное состояние, что и происходит после «обстрела» электронами.

Таким образом, сканирующий электронный микроскоп может быть оснащен несколькими типами детекторов, которые дают информацию о разных свойствах объекта и, следовательно, разные картинки. Но все они черно-белые: самый интенсивный сигнал приходит от «белых» участков, а в «черных» — полное отсутствие сигнала (рис. 2). Про работу BSD уже было сказано выше, а в случае с элементным составом — чем больше атомный номер и масса химического элемента на данном участке, тем он светлее на электронограмме. Хотя анализ дает представление о композиции химических элементов, а не сложных веществ, по относительному содержанию углерода и, например, металлов можно отличить органические вещества от неорганических.

Атомный номер, он же зарядовое число, отражает число протонов в ядре атома какого-либо химического элемента. Поэтому чем больше протонов, тем больше и масса. Но, поскольку масса складывается из числа протонов и нейтронов в ядре, а количество последних для одного химического элемента непостоянно, корректнее будет сказать, что более светлые участки на электронограмме от EDS-детектора имеют больший заряд (и больший номер в таблице Менделеева).

Метагеномика

ДНК выделяли прямо из мембраны фильтра, который был надет на вакуумную трубку для сбора образцов. Как и ожидалось, ДНК вышло немного. Материал с каждой точки сбора на одной картине объединяли, чтобы получить информацию обо всем ее микробиоме.

Принципиально важным здесь было использование не классической ПЦР, а multiple displacement amplification (MDA, дословно «многократная амплификация смещения»). Этот метод позволяет из небольшого количества ДНК наработать адекватное для анализа, поэтому все чаще используется для single-cell-анализа и в криминалистике, например. В MDA (рис. 3) применяют полимеразу фага φ29, которая на 2–3 порядка точнее Taq-полимеразы (1 ошибка на 10⁶ или даже 10⁷ оснований против 1 на 9000) и синтезирует довольно длинные фрагменты свыше 10 тысяч оснований. Учитывая вероятность ошибки при определении нуклеотидов с помощью MinION, точность этой полимеразы уже не имеет такого значения. Она же, кстати, используется для SMRT-секвенирования (PacBio) — еще одного метода секвенирования третьего поколения.

Оптимальная температура для проведения MDA — около 30 °C, что значительно ниже, чем необходимые для ПЦР 70–80 °C. Праймеры здесь не специфичные для последовательности, а рандомные, состоящие из шести нуклеотидов. Значит, их отжиг (комплементарное взаимодействие) может произойти на случайном участке исходной ДНК, а также на вновь синтезированных фрагментах, позволяя многократно копировать исходную матрицу. Поэтому этот метод отлично подходит для полногеномной амплификации, к которой и стремились авторы.

Минусы метода, о которых авторы не упомянули:

• праймеры могут взаимодействовать друг с другом;
• преимущественная амплификация одной из аллелей у гетерозигот.

Но, видимо, с таким небольшим количеством ДНК привередничать не приходится... Второй минус не так важен в данном исследовании, но в криминалистике, например, это могло бы отразиться на результатах.

Результаты

Никогда такого не было, и вот опять.
В.С. Черномырдин

Итак, что же именно исследователи разглядели в точках сбора образцов? Как показала EDS, подозрительные «инкрустации» в бумаге содержали довольно много органики, в том числе и соли мочевой кислоты. А богатый исследовательский опыт и молекулярные данные помогли установить, что это ни что иное как экскременты насекомых, причем, по большей части, обычной комнатной мухи. Также в СЭМ удалось рассмотреть споры грибов и пылевые частицы. Обнаружение органических загрязнений — тревожный знак, потому что богатые азотом соединения вроде мочевой кислоты способствуют разрушению бумаги и привлекают микроорганизмы, нуждающиеся в этом макроэлементе.

Что касается данных метагеномного анализа, наибольшее разнообразие «населения» выявили на образцах L7 и L8, они вообще оказались довольно схожи. Наименьшее разнообразие — на L4 (рис. 4).

Результаты исследований, проводимых ранее с помощью других методов секвенирования и сбора образцов, свидетельствовали о том, что на полотнах и бумаге предпочитают селиться (или преимущественно выживают?) грибы [10]. Но на всех рисунках, кроме L4, преобладали, как ни странно для экспертов в сфере реставрации, не плесневые грибы и даже не эукариоты, а бактерии (рис. 5). По большей части это были протеобактерии, также довольно значительна была фракция актинобактерий и фирмикут, а на одной картине (L3) нашли даже цианобактерий. Из эукариот на всех работах, кроме L4, преобладали аскомицеты — тип грибов, который, наверное, любому читателю известен по таким его представителям, как Penicillium и Aspergillus. «Да что же это за L4?» — возникает вопрос. А дело в том, что 74,64% отсеквенированной ДНК с этой картины принадлежало... хордовым, а точнее человеку. Вполне вероятно, что это «заглушило» сигнал от населяющих картину микроорганизмов. Как выяснилось, ранее проводилась более долгая и глубокая, чем в случае других картин, деконтаминация (зачистка) L4, приведшая, по всей вероятности, с одной стороны, к снятию большего количества верхнего слоя пыли с микроорганизмами, а с другой — к большему загрязнению человеческим биоматериалом.

Более того, Леонардо покрыл бумагу для L4 грунтом из свинцовых белил, индиго, измельченных куриных костей и желатина, что могло стать еще одной причиной небольшого количества микроорганизмов на ее поверхности, кроме тех, что были занесены во время реставрации.

Соотношение микроорганизмов на поверхности рисунков, а именно преобладание бактерий над грибами, удивило Пиньяр и ее коллег. По их словам, ранее схожие результаты не были опубликованы. Возможно, новые данные позволят иначе взглянуть на микробиом произведений искусства и сопутствующие экспансии микроорганизмов риски. Однако авторы допускают и другие объяснения этим результатам, что и хочется видеть в научных статьях. Итак, преобладание ДНК бактерий может быть связано с:

• Предложенным авторами методом сбора материала. Возможно, он больше подходит для пылевых частиц, поэтому удалось собрать только споры грибов и совсем небольшие участки мицелия, но гораздо больше бактерий. Это могло отразиться на результатах, поскольку выбранный метод секвенирования дает представление о соотношении прочтенных последовательностей.
• Условиями хранения работ Леонардо. Значимые и древние произведения, которые в данный момент не выставляются, хранят в специальных контейнерах, которые пропускают только очень мелкие частички пыли, на которых чаще находятся бактерии [11], а клетки грибов почти не проходят через такой барьер.
• Условиями реставрации. Люди могли контаминировать рисунки своими симбионтами, например стафилококком, стрептококком и кишечной палочкой, которыми наша кожа, верхние дыхательные пути и кишечник соответственно буквально кишат. Да и некоторые виды рода Candida так просто в воздухе не витают, они прочно ассоциированны с человеком. А в случае с L4, скорее всего, произошла контаминация именно человеческим «биоматериалом» — чаще всего это роговые чешуйки кожи.
• Предыдущие методы предполагали предшествующий молекулярному анализу посев собранного материала на культуральные среды, на которых, возможно, преимущественно росли грибы.
• Таргетная амплификация, на которой основывались предыдущие методы, не отражает реальной пропорции микроорганизмов.

Что касается разнообразия обнаруженных грибов, набор напоминал предыдущие работы по теме. На большинстве рисунков присутствовали организмы, устойчивые к низкой влажности, но про присутствие представителей родов Colletotrichum и Bipolaris на картинах не было известно, потому что это фитопатогены. С другой стороны, не так уж это и удивительно, потому что все эти организмы синтезируют ферменты для расщепления целлюлозы и гемицеллюлозы растительных клеточных стенок, которыми они, вероятно, активно пользуются при колонизации рисунков. Именно такие грибы могут быть ответственны за разрушение бумаги. Кроме того, обнаруженные с помощью оптического и электронного микроскопов экскременты насекомых содержали их грибных и бактериальных симбионтов.

Исходя из этих данных удалось распределить картины на две группы с помощью статистического метода PCA (principal component analysis, метод главных компонент). Чем ближе на графике расположены точки, тем более они схожи по выбранным авторами компонентам для анализа. Слева на графике (рис. 6) во внимание принимали бактериальную биоту, справа — грибную. По обоим показателям выделялись L7 и L8. Совпадение ли, что только эти две картины находятся в Риме, а остальные — в Турине?

Два произведения из Турина «выпадают» из общей группы. Скорее всего, L5 выделяется по грибному разнообразию из-за представителей рода Grosmannia, обнаруженных только на этом произведении, причем в большом количестве (12,6% от всех прочтений). Этот растительный патоген вызывает голубое окрашивание древесины североамериканских хвойных деревьев. Возможно, арт-объект когда-то контактировал с зараженным деревянным инструментом, или всему виной декоративные псевдотсуги Мензиса, выращиваемые на севере Италии.

А в случае с L2 — предполагаемым автопортретом да Винчи — история еще более загадочная. В 1987 году директор биологической лаборатории бывшего Центрального института патологии книги (Istituto Centrale per la Patologia del Libro) Фауста Галло сообщил, что картина подверглась воздействию критической влажности воздуха вплоть до 90%, из-за чего рекомендовал стерилизацию оксидом этилена — алкилирующим агентом, делающим невозможным полимеризацию ДНК и РНК, в том числе и при ПЦР. Но Гваделупе Пиньяр и ее коллеги не знали, проводилась ли она на самом деле [1], [12]. Однако исследование 2012 года с использованием преимущественно микроскопии, опубликованное в 2015-ом [13], выявило заражение картины грибом Eurotium halophilicum, вызывающим появление рыжих пятен на бумаге (англ. foxing) и хорошо различимым в СЭМ. При этом ни методы NGS, ни технология Nanopore не выявили его присутствия. Вероятно, стерилизация оксидом этилена все же была проведена, что и сделало этот гриб, а возможно, и какие-то другие организмы, «невидимыми» для молекулярных методов. Это тот самый случай в науке, когда отсутствие результата может служить надежным подтверждением гипотезы.

Заключение

Работа Пиньяр и соавторов, несомненно, выделяется на фоне рутинных исследований, предшествующих реставрации. Пусть это не исчерпывающий анализ (к нему можно было подключить некоторые другие физические методы), но полученные данные опровергают устоявшиеся стереотипы о микробиоме картин и ставит вопросы, требующие дальнейших исследований. В данном случае авторы уже обладали некоторой информацией, которая была подтверждена в их работе. Поэтому, возможно, такой комплексный подход поможет пролить свет и на неизвестные ранее факты. Кроме того, эта методика — еще один шаг на пути разработки более совершенных процедур анализа редких и ценных объектов, в случае которых хочется получить максимально разностороннюю информацию из минимального количества образцов. Полученные результаты, а точнее их грамотная интерпретация, ценны для музейщиков, арт-дилеров, коллекционеров и реставраторов, так как эти знания помогут не навредить арт-объектам еще больше в попытках их восстановить, а также сделать процедуры реставрации более эффективными. А для ученых такие исследования — возможность прикоснуться к прекрасному (надеюсь, в перчатках и очень осторожно).

Литература

1. Guadalupe Piñar, Maria Carla Sclocchi, Flavia Pinzari, Piero Colaizzi, Alexandra Graf, et. al.. (2020). The Microbiome of Leonardo da Vinci’s Drawings: A Bio-Archive of Their History. Front. Microbiol.. 11;
2. Claudia Schabereiter-Gurtner, Guadalupe Piñar, Werner Lubitz, Sabine Rölleke. (2001). An advanced molecular strategy to identify bacterial communities on art objects. Journal of Microbiological Methods. 45, 77-87;
3. Криминалистика. Молекулярно-генетическая экспертиза;
4. Повтор, еще повтор!;
5. 12 методов в картинках: секвенирование нуклеиновых кислот;
6. 12 методов в картинках: протеомика;
7. 12 методов в картинках: микроскопия;
8. 12 методов в картинках: полимеразная цепная реакция;
9. Guadalupe Piñar, Caroline Poyntner, Ksenija Lopandic, Hakim Tafer, Katja Sterflinger. (2020). Rapid diagnosis of biological colonization in cultural artefacts using the MinION nanopore sequencing technology. International Biodeterioration & Biodegradation. 148, 104908;
10. Flavia Pinzari, Giovanna Pasquariello, Antonella De Mico. (2006). Biodeterioration of Paper: A SEM Study of Fungal Spoilage Reproduced Under Controlled Conditions. Macromol. Symp.. 238, 57-66;
11. Jinho Yang, Eun Kyoung Kim, Hyeon Ju Park, Andrea McDowell, Yoon-Keun Kim. (2020). The impact of bacteria-derived ultrafine dust particles on pulmonary diseases. Exp Mol Med. 52, 338-347;
12. Pinzari F., Sclocchi M.C., Colaizzi P., Valenti P. Indagini microbiologiche e microscopiche. In Atti del Seminario Internazionale I disegni di Leonardo. Diagnostica Conservazione Tutela / ed. by M.C. Misiti, M.C. Misiti. Roma: ICRCPAL-Sillabe, 2014. P. 56–65;
13. Guadalupe Piñar, Hakim Tafer, Katja Sterflinger, Flavia Pinzari. (2015). Amid the possible causes of a very famous foxing: molecular and microscopic insight into L eonardo da V inci's self‐portrait. Environmental Microbiology Reports. 7, 849-859.