Конкурс «Био/Мол/Текст»-2023/2024

Эта работа опубликована в номинации «Синтетическая биология» конкурса «Био/Мол/Текст»-2023/2024.

Генеральный партнер конкурса — международная инновационная биотехнологическая компания BIOCAD.

---

«Книжный» спонсор конкурса — «Альпина нон-фикшн»

Синтезировать, да не высинтезировать

Синтетическая биология существует уже далеко не первый день, поэтому само по себе словосочетание «синтетическая клетка» уже не вызывает никакого удивления. Ученые научились и синтезировать геном с нуля, и внедрять его в уже живые клетки [1], [2].

Более подробно ознакомиться с областью вы можете в статьях «Синтетическая биология: от программирования компьютеров к программированию клеток» [3] и «Синтетическая биология: от наблюдения к вмешательству» [4] на портале «Биомолекула».

Даже создание синтетических клеток — уже известная науке технология. Чаще всего для этого используется метод эмульсионно-капельного переноса (рис. 1) [5]. В результате получаются везикулы с двойной липидной мембраной — вполне себе модель живой клетки.

Если вставить в такую систему мембран генетический аппарат, то получится неживая клетка, способная вести себя, как живая [6]. Отличие такой структуры от живой клетки — их способность обладать любыми свойствами, которые им присвоит человек [7].

Транскрипция у синтетических клеток в разы проще, чем у живых. В живых клетках синтез РНК на матрице ДНК — сложный процесс, в котором участвуют ферменты и некоторые другие белки, и который состоит из разных стадий. Транскрипиция контролируется набором белков, которые должны объединиться с кофакторами (другими белками), чтобы образовать комплексы, стимулирующими или подавляющими синтез РНК. Этих факторов большое множество, они отличаются у эукариот и у прокариот.

В синтетических клетках для регуляции транскрипции ученые используют только несколько четко определенных факторов транскрипции, чувствительных к малым молекулам или трансляционным рибопереключателям (рис. 2) [8].

Рибопереключатель — элемент 5’-некодирующей области РНК, который участвует в регуляции мРНК. Он состоит из двух участков: аптамера, чувствительного к связыванию с малыми молекулами, и платформы экспрессии, взаимодействующей с белками трансляции. При связывании аптамера с малыми молекулами конформация участка между аптамером и платформой экспрессии изменяется, изменяя вторичную структуру РНК, за счет чего и происходит регуляция.

Коммуникация синтетических клеток происходит двумя способами: за счет высвобождения сигнальных молекул, не проникающих через мембраны (с использованием α-гемолизина), или же за счет способных проникать через мембраны ацилгомосеринлактонов (АГСЛ, основные молекулы для коммуникации у живых бактерий) [7].

У этих методов есть и свои ограничения, например, несовместимость работы некоторых АГСЛ друг с другом [7]. Ученые постоянно совершенствуют системы синтетических клеток и придумывают новые методы для организации их коммуникации и трансляции. В статье, о которой мы поговорим, как раз приведен один из таких усовершенствованных механизмов: как клетки и бактерии научились общаться с помощью света.

В начале была мембрана

План у ученых, на первый взгляд, был простой: создать синтетические клетки, испускающие сигнал, модифицировать живые бактерий так, чтобы они этот сигнал понимали — и вуа-ля! Но обо всем по порядку.

Сначала было решено сконструировать такие искусственные клетки, которые бы отдавали в окружающую среду понятный для живых бактерий сигнал.

С помощью эмульсионно-капельного фазового переноса исследователи создали из фосфатидилхолина довольно большие, 3–20 нм в диаметре, синтетические везикулы. Далее предстояло сконструировать и ввести генетический конструкт [7].

Новаторство этого исследования — использование света для регуляции трансляции. Ученые подумали, что это может оказаться очень удобно — «включать» и «выключать» клетки световым сигналом — такое может пригодиться и в онкологии, и в других областях медицины! В связи с этим генетический конструкт они сделали светочувствительным. Он состоял из светочувствительного промотора фага Т7, сильного сайта связывания рибосомы (ССР), гена интереса (ГИ) и терминатора фага Т7. Геном интереса был выбран флуоресцентный белок mNeonGreen (рис. 3).

Необходимо было убедиться, что ДНК в синтетической клетке действительно светочувствительная. Для этого ученые доставили генетический конструкт внутрь клетки. Оказалось, что внутри синтетической клетки экспрессия генов зависит от наличия УФ-света — система работала (рис. 3)!

По команде стройся

Итак, искусственные клетки были готовы к тому, чтобы «включаться» и «выключаться» по ультрафиолетовой команде. Объясним здесь, почему исследователи выбрали именно свет в качестве переключателя.

Преимущество света перед малыми молекулами для активации транскрипции заключается в том, что такую систему проще контролировать в пространстве. Это ученые подтвердили на первом этапе эксперимента. Они поместили синтетические везикулы в агарозу, чтобы те не двигались, и облучили их УФ-светом. В результате получились говорящие сами за себя снимки — клетки можно включать и выключать очень избирательно (рис. 4).

Теперь предстояло запрограммировать клетки так, чтобы они по команде производили молекулы, сигнал от которых был бы «понятен» бактериям.

Для этого ученые внесли в синтетические клетки генетический конструкт, кодирующий фермент BjaI (АГСЛ-синтазу). Его функция заключается в том, что он превращает субстраты изовалерил-кофермент А (ИВ-коА) и S-аденозилметионин (SAM) в N-изовалерил-L-гомосерин лактон (ИВ-ГСЛ) (рис. 5).

Молекулы субстрата крупные, заряженные и не проходят через мембрану, а молекулы ИВ-ГСЛ — существенно меньше и через мембраны проходят. Таким образом, в синтетических клетках, содержащих субстрат и генетических конструкт, экспрессирующий BjaI, происходит синтез ИВ-ГСЛ. Он же, в свою очередь, проходит через клеточную мембрану и воспринимается бактериальными клетками (рис. 5).

Ученым необходимо было удостовериться, не мешают ли молекулы субстрата синтезу фермента BjaI, ведь всякое может случиться. Чтобы убедиться, что все в порядке, они проинкубировали вместе субстрат, внеклеточную систему синтеза BjaI и бактериальные клетки-реципиенты. Все оказалось в полном порядке! Можно было продолжать работу.

Тщательная подготовка

Оставалось трансформировать принимающую сторону, то есть бактериальные клетки-реципиенты, таким образом, чтобы было видно, реагируют они на сигнал от синтетических клеток (доноров) или нет. Для этого ученые взяли линию E. coli и трансформировали ее с помощью плазмиды [11].

Генетический конструкт исследователи организовали следующим образом. Транскрипционный фактор BjaR экспрессировался в любом случае, так как он находился под контролем постоянно активного промотора. Белок же GFP производился только тогда, когда BjaR, связавшись с ИВ-ГСЛ, взаимодействовал с промотором и привлекал к нему РНК-полимеразу. Если связывания BjaR с ИВ-ГСЛ не происходило, то белок GFP не экспрессировался. Конечно, ученые проверили, хорошо ли светятся клетки в ответ на ИВ-ГСЛ — система оказалась довольно чувствительной (рис. 6).

Однако свечение клеток без ИВ-ГСЛ все же, увы, наблюдалось. Чтобы понять, почему так происходит, ученые сделали линию клеток без гена BjaR и ввели туда ту же плазмиду. Ура! Свечения без ИВ-ГСЛ больше не было.

Ученые всегда перфекционисты. И авторы работы хотели, чтобы система была идеальной и никакого свечения в отсутствие субстрата не было вообще. Чтобы этого достигнуть, они решили использовать направленную эволюцию BjaR. Да-да, оказывается, можно заставить белок эволюционировать в нужном для нас направлении.

Итак, исследователи устроили отбор нужных клеток-мутантов. С помощью ПЦР они создали библиотеку мутантных генов BjaR [12] — всего 45 штук — и провели отбор функциональных вариантов BjaR. Затем они обогатили библиотеку: промыли клетки, вырастили их в среде без ИВ-ГСЛ и отобрали наиболее быстро растущие клоны. Плазмиды из всех клеток, оставшихся после фазы роста, затем использовали в качестве матрицы ДНК для трансформации в следующем раунде эволюции. Всего ученые провели четыре таких раунда.

В итоге исследователи отобрали трех победителей и отсеквенировали их геном. Оказалось, что мутации находились в кодоне инициации трансляции. Чтобы убедиться, действительно ли мутанты лучше подходят для эксперимента, ученые вставили мутантный ген в плазмиду и проверили уровень свечения — все было в порядке. Наилучшие результаты показал кодон ACG.

Чтобы еще усовершенствовать систему, исследователи попробовали модифицировать расположенный перед BjaR сайт, связывающийся с рибосомой. Это привело к дозозависимому усилению флуоресценции, благодаря чему и был отобран лучший вариант BjaR. Итак, была проделана огромная работа: что же дальше?

Взаимодействие клеток

Итак, все было готово. Оставалось проверить, работает ли система, общаются ли клетки между собой? Исследователи зафиксировали синтетические клетки в агарозе, чтобы воздействие света было направленным. Поверх них нанесли клетки-реципиенты. Включили ультрафиолет и... Вуаля! Клетки E.coli светились красивым зеленым цветом (рис. 7).

Давайте еще раз проговорим механизм взаимодействия, который включался между синтетическими клетками и бактериями при включении УФ-света.

Итак, когда включается свет, в синтетических клетках продуцируется фермент BjaI, который в присутствии молекул субстрата синтезирует из них N-изовалерил-L-гомосеринлактон. В бактериальных клетках стабильно продуцируется транскрипционный фактор BjaR, который, связавшись с ИВ-ГСЛ от синтетических клеток, активирует экспрессию гена светящегося белка GFP [13].

В чем же фишка?

В этой работе ученые отказались от управления транскрипцией ДНК с помощью веществ природного происхождения. Вместо этого они использовали УФ-свет для точного контроля активации синтетических клеток с химически модифицированными матрицами ДНК.

В данной конкретной модели УФ-свет стимулировал фоторасщепления 2-нитробензильных групп, содержащихся в промоторах T7 ДНК. Однако модульная природа таких промоторов делает их полностью настраиваемыми. Изменив конфигурацию промотора, можно отрегулировать экспрессию генов и заставить клетки реагировать на более биосовместимый и лучше проникающий в ткани видимый или ближний инфракрасный свет.

Помимо того, что это все очень интересно, в чем же фишка таких исследований? Как они могут помочь непосредственно людям? Во-первых, синтетические клетки можно использовать для изучения механизмов клеточной коммуникации в целом, например, в биопленках. Во-вторых, синтетические клетки, активируемые ближним инфракрасным светом, теоретически можно использовать в качестве устройств доставки лекарств, которые выделяли бы лекарственные малые молекулы или белки в нужном месте.

Только представьте себе — по сигналу можно будет заставить клетки выделять лекарства в каком-то конкретном месте организма именно в то время, когда решит врач! Кажется, за такое будущее фармакотерапии ученым точно стоит побороться!

Литература

1. Синтезировать-невысинтезировать!;
2. Синтетическая жизнь;
3. Синтетическая биология: от программирования компьютеров к программированию клеток;
4. Синтетическая биология: от наблюдения к вмешательству;
5. Sophie Pautot, Barbara J. Frisken, D. A. Weitz. (2003). Production of Unilamellar Vesicles Using an Inverted Emulsion. Langmuir. 19, 2870-2879;
6. Vincent Noireaux, Albert Libchaber. (2004). A vesicle bioreactor as a step toward an artificial cell assembly. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.. 101, 17669-17674;
7. Jefferson M. Smith, Denis Hartmann, Michael J. Booth. (2023). Engineering cellular communication between light-activated synthetic cells and bacteria. Nat Chem Biol. 19, 1138-1146;
8. Katarzyna P. Adamala, Daniel A. Martin-Alarcon, Katriona R. Guthrie-Honea, Edward S. Boyden. (2017). Engineering genetic circuit interactions within and between synthetic minimal cells. Nature Chem. 9, 431-439;
9. Jefferson M. Smith, Razia Chowdhry, Michael J. Booth. (2022). Controlling Synthetic Cell-Cell Communication. Front. Mol. Biosci.. 8;
10. Roberta Lentini, Noël Yeh Martín, Michele Forlin, Luca Belmonte, Jason Fontana, et. al.. (2017). Two-Way Chemical Communication between Artificial and Natural Cells. ACS Cent. Sci.. 3, 117-123;
11. Stefan J. Tekel, Christina L. Smith, Brianna Lopez, Amber Mani, Christopher Connot, et. al.. (2019). Engineered Orthogonal Quorum Sensing Systems for Synthetic Gene Regulation in Escherichia coli. Front. Bioeng. Biotechnol.. 7;
12. Yuki Kimura, Shigeko Kawai-Noma, Kyoichi Saito, Daisuke Umeno. (2020). Directed Evolution of the Stringency of the LuxR Vibrio fischeri Quorum Sensor without OFF-State Selection. ACS Synth. Biol.. 9, 567-575;
13. Andrea Lindemann, Gabriella Pessi, Amy L. Schaefer, Margrith E. Mattmann, Quin H. Christensen, et. al.. (2011). Isovaleryl-homoserine lactone, an unusual branched-chain quorum-sensing signal from the soybean symbiont Bradyrhizobium japonicum. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.. 108, 16765-16770.