Конкурс «био/мол/текст»-2014

Эта статья представлена на конкурс научно-популярных работ «био/мол/текст»-2014 в номинации «Лучший обзор».

---

Главный спонсор конкурса — дальновидная компания «Генотек».
Конкурс поддержан ОАО «РВК».

---

Спонсором номинации «Биоинформатика» является Институт биоинформатики.
Спонсором приза зрительских симпатий выступила фирма Helicon.
Свой приз также вручает Фонд поддержки передовых биотехнологий.

Многие сорта плодовых культур имеют тенденцию к периодичному плодоношению — чередованию высокоурожайных и неурожайных лет. При этом в годы с высокой урожайностью товарный вид плодов хуже (они мелкие и зачастую плохого качества), а поэтому и урожайные, и неурожайные годы наносят экономические потери. Периодичность плодоношения — широко распространенный феномен как среди листопадных, так и среди вечнозеленых деревьев. В результате многолетних наблюдений в промышленных садах мира выявлены семейства, роды и виды, у которых была обнаружена изучаемая нами характеристика (табл. 1).

Из таблицы видно, что эта черта свойственна многим видам и сортам. Логично предположить, что в ее основе лежат естественные для цветковых растений процессы, и существует генетический контроль этого процесса. В свете этого виды и сорта, у которых не было отмечено периодичности плодоношения, становятся интересными объектами исследования [31], [32].

Какие же генетические особенности были выявлены при изучении периодичности плодоношения у разных культур? Во-первых, было обнаружено влияние зоны произрастания — характер плодоношения одних и тех же сортов в разных зонах выращивания различался. К примеру, сорта яблони Голден Делишез и Уеллоу Транспарент определены одними авторами как «периодичные» [43], а другими — как «непериодичные» [21]. У цитрусовых культур сорта апельсина, грейпфрута и лимона обычно имеют регулярный характер плодоношения, но в определенных климатических условиях (внутри материка, в засушливых районах Австралии) сорт апельсина Валенсия проявлял сильно выраженную периодичность [33]. Эти наблюдения у яблони и цитрусовых наталкивают нас на мысль, что периодичность плодоношения может зависеть от места произрастания и условий культивирования.

Во-вторых, было обнаружено, что среди цитрусовых культур мандарин и его гибриды, такие как Муркотт, Кинноу, Уилкинг часто характеризуются наиболее выраженной периодичностью. Японский мандарин Сатсума, который выращивается и в нашей стране в районе Большого Сочи, а также в ближнем зарубежье — Абхазии и Грузии, как один из наиболее холодостойких видов цитрусовых, — также имеет выраженную периодичность плодоношения. Следовательно, налицо вторая предпосылка возникновения периодичности — особенности генотипа.

Причины различий по характеру плодоношения между сортами не до конца изучены. Различные гипотезы включают влияние расположения цветочных почек, способность к перекрестному опылению, различные реакции растений на климатический стресс, подвой, на котором привит сорт, возраст дерева и другие [9], [21]. Культивирование регулярно плодоносящего сорта апельсина Шамоути в Израиле на подвое sour orange (кислый апельсин) стало причиной периодичного плодоношения многих генотипов цитрусовых, привитых на него в Средиземноморье [21]. С возрастом у некоторых видов периодичность плодоношения усиливалась [9]. Кроме того было замечено, что отдельные ветви плодовых деревьев часто имеют автономный характер плодоношения и эта автономия усиливается с увеличением размера ветви, что было показано на примере сливы [5]. При этом была разработана формула расчета степени автономии ветвей, и было выявлено, что у сортов Bonne de Bry, Prune d’Ente, Reine Claude степень автономии ветвей составляла 85–90%, а у клона Reine Claude — лишь 30%. Однако даже у сортов с высоким процентом автономии главная ветвь на дереве не полностью автономна, и низкое плодоношение на других ветвях вызывает, как правило, повышенное образование цветочных почек на главной ветви. Таким образом, имеет место взаимное влияние между плодоносящими и неплодоносящими частями дерева [5].

На первый взгляд может быть не совсем понятно, какое отношение все эти особенности имеют к возникновению периодичности плодоношения. Однако при более пристальном рассмотрении мы начинаем понимать, как все они взаимосвязаны и обусловливают характер плодоношения.

Причины возникновения периодичности плодоношения

Недостаток цветков, избыток плодов или отсутствие надлежащего вегетативного роста могут инициировать цикличное поведение. Однажды инициированное, оно может продолжаться в течение нескольких лет благодаря своей самопорождающей природе. В результате многолетних наблюдений было установлено, что к периодичному плодоношению могут привести две ситуации:

1. неурожайный год, вызванный недостатком цветков, слабым завязыванием плодов или чрезмерным опадением завязей;
2. очень урожайный год с крупными плодами, большим количеством завязей, низким процентом опадением плодов.

Для установления причин периодичности плодоношения необходимо выявить специфические взаимосвязи между развитием плодов текущего года, инициацией цветочных почек следующего года и вегетативным ростом обоих лет, что представляет собой большую сложность. Отдельные причины, порождающие периодичность, разделяют на две группы: экзогенные (внешние) и эндогенные (внутренние) (рис. 1). Экзогенные факторы (мороз, недостаточное опыление, засуха, болезни) обычно начинают цикл периодичности, резко сокращения урожай текущего года. Дальнейшее сохранение цикличного поведения происходит благодаря эндогенным (гормональным, биохимическим и молекулярным) факторам.

Экзогенные факторы

Экзогенные факторы периодичности плодоношения — климатические условия, почвенные условия, вредители и болезни. Климатические стрессы (например, заморозки) могут влиять на характер плодоношения не только прямо, но и опосредованно [40], вызывая несвоевременное опадение листьев, что приводит к изменению гормонального баланса, который, в свою очередь, влияет и на формирование цветочных почек. Кроме того, от температуры зависит активность насекомых-опылителей, участвующих в процессе переноса пыльцы и завязывания плодов. Низкая влажность воздуха также может вызывать опадение завязей и листьев, инициируя периодичность плодоношения [1]. Почвенные условия, водный баланс растений также оказывают влияние на характер плодоношения. Кроме этого, такие факторы среды, как насекомые или болезни, атакуя цветки, молодые плоды и другие органы растения могут прямо или косвенно вызывать периодичность плодоношения [45].

Следует отметить, что условия среды, которые не вызывают периодичность в одной зоне произрастания, могут быть индукторами периодичности в другой. Кроме того, одни и те же экстремальные факторы среды по-разному могут действовать на разные сорта, т.е. есть сорта предрасположенные и непредрасположенные к периодичности плодоношения. Здесь уже мы переходим к выявлению эндогенных факторов, влияющих на характер плодоношения.

Эндогенные факторы

Эндогенные факторы периодичности плодоношения — это биологические особенности самого растения, обусловленные гормональными и генетическими механизмами. Например, присутствие плодов на дереве ингибирует цветение у яблони и цитрусовых. Эта особенность объясняется физиологическими причинами — гормоны растений ауксины, гиббереллины и абсцизовая кислота, образующиеся в семенах, транспортируются через плодоножку в растение, регулируя дальнейшее направление развития пазушных меристем. Этот процесс происходит активнее именно у периодичных сортов [18]. Однако не все так однозначно: бессемянные сорта мандарина Сатсума, к примеру, проявляли высокую периодичность плодоношения. Следовательно, влияние семян не является определяющим эндогенным фактором.

Другие органы — листья — играют важную роль в характере плодоношения. Они синтезируют гормоны и питательные вещества, которые участвуют в репродуктивных процессах (образование и развитие цветков и плодов).

Важной биологической особенностью регулярно плодоносящих (непериодичных) сортов является их способность к самопрореживанию — контролю количества опадающих завязей в соответствии со своим потенциалом плодоношения, что обусловливает получение среднего количества урожая ежегодно [13]. Это свойство генетически обусловлено. Таким образом, мы подходим к тому, что первичными эндогенными факторами, обусловливающими характер плодоношения, являются гормональные и генетические.

Гормональные факторы, регулирующие цветение

Было выявлено, что наиболее важную роль из фитогормонов в регуляции цветения выполняют гиббереллины [2]. Как было показано на примере яблони, эндогенные гиббереллиновые механизмы, ответственные за цветение, в малой степени зависят от действия экзогенных факторов [34]. Очевидно, ГК выполняют регуляторную функцию при репродуктивном и вегетативном развитии растения [15] и они тесно связаны с механизмами, регулирующими периодичность плодоношения.

Известно, что программа развития апикальной меристемы по пути образования листьев и побегов может «переключиться» в образование цветочных органов. Такое переключение происходит резко, оно генетически необратимо, и предполагается, что регулируется оно массивной сетью генов-регуляторов. Момент, в который осуществляется такая резкая перестройка, строго определяется эндогенными и экзогенными сигналами. В последние годы были выявлены семейства генов, задействованных в реализации этих механизмов, и была определена их регуляторная роль.

Молекулярные механизмы цветения

Так как регулярность плодоношения — характеристика, зависящая в большей степени от индукции цветения, чем от последующего развития цветочных органов, предполагается, что в периодичность плодоношения вовлечены гены-интеграторы цветения.

Ключевые гены, регулирующие развитие цветочных меристем, были идентифицированы у модельных объектов Antirrhinum majus и Arabidopsis thaliana. К ним относят ген-промотор цветения FLOWERING LOCUS T (FT), который кодирует белок, являющийся составным компонентом так называемого «флоригена» — мистического фактора цветения [22], и гены LEAFY (LFY) и APETALA1 (AP1), которые считаются специфичными генами, работающими только в цветочных меристемах. Другие гены, такие как FLOWERING LOCUS C (FLC), TERMINAL FLOWER 1 (TFL1), BROTHER OF FT (BFT) и SHORT VEGETATIVE PHASE (SVP) известны как репрессоры генеративного пути развития меристем. Все эти гены индукции цветения одинаковы как у арабидобсиса, так и у многолетних плодовых растений [17]. Более того, было показано, что многие из них непосредственно участвуют в обменных процессах в клетке [14].

Несмотря на активные исследования регуляции цветения, конкретные молекулярные механизмы и причины, вызывающие периодичность плодоношения, до сих пор неизвестны [2]. Отчасти это связано с тем, что в большинстве исследований в качестве модельных объектов для изучения механизмов цветения использовали травянистые лекарственные растения Arabidopsis thaliana и Antirrhinum majus. Однако многолетние плодовые растения имеют характерные особенности в формировании и развитии цветочных почек и более сложное строение цветка, чем у этих модельных видов.

Молекулярные механизмы цветения цитрусовых культур

Для выявления специфичных цитрусовым молекулярных механизмов цветения было предпринято несколько исследований. Одной из первых таких работ стала работа L. Pena с коллегами [35], которые показали роль генов APETALA1 (AP1) и LEAFY (LFY) в ювенильной фазе у трансгенных цитрусовых. Позже были выделены CsAP1 и CsLFY [36], которые участвуют как в определении сроков цветения, так и в развитии цветочных почек [7]. Регуляторная роль гена FLOWERING LOCUS T (FT) была определена у многих видов, включая цитрусовые культуры. Кроме того, была выявлена обратная взаимосвязь между урожайностью и экспрессией генов FT, AP1 и SOC1 в листьях мандарина «Монкада», особенно в период индукции цветения [30].

Другие гены, такие как CONSTANS (CO) и SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CONSTANS 1 (SOC1), участвуют во взаимодействии различных путей развития меристем цитрусовых. У арабидопсиса они вовлечены в образование репродуктивных органов из вегетативных [7], [23], [28], [36].

Изучение характера экспрессии генов цветения показало, что созревающие плоды подавляют цветение путем подавления работы генов CiFT и SOC1 в листьях у сортов цитрусовых, характеризующихся высокой периодичностью плодоношения. Плоды также снижают экспрессию гена CsAP1 в листьях и значительно повышают уровень экспрессии гена CsLFY [30].

Среди генов, индуцирующих неурожайный период SQUAMOSA PROMOTER BINDING-LIKE (SPL), у цитрусовых выделен ген miR156, который контролирует переход из ювенильной в плодоносящую фазу, а также смену вегетативной и генеративной фаз в течение года. Характер экспрессии miR156 и других генов цветения позволяет предположить, что плоды в процессе созревания влияют на дальнейший путь морфогенеза почек в течение продолжительного времени — до следующего периода цветения.

Молекулярные механизмы цветения яблони

У яблони также был выделен ряд специфичных генов, последовательности нуклеотидов в которых оказались сходными с генами индукции цветения арабидопсиса. Были изучены особенности экспрессии этих генов [10], [26], [27]. Сверхэкспрессия ортологичных генов LFY, AFL1 и AFL2 (APPLE FLORICAULA/LFY), а также генов MdMADS2 и MdMADS5, ортологичных генам FRUITFULL (FUL) и AP1 арабидопсиса, приводила к раннему цветению яблони [24]. Напротив, сверхэкспрессия TFL1 гена, ортологичного гену MdTFL1, задерживала цветение у арабидопсиса [25]. В дальнейшем Kotoda с коллегами [26] показал, что трансгенные растения яблони сорта «Ореон» с редуцированным уровнем транскрипции MdTFL1 зацветали через 8 месяцев после прививки, тогда как нетрансформированные растения ни разу не зацвели в течение 5 лет после прививки.

Несмотря на множество выявленных генов цветения, лишь недавно были впервые предприняты попытки идентифицировать генетические и молекулярные факторы периодичности плодоношения яблони [16]. Эти исследователи использовали количественный генетический анализ для определения локусов количественных признаков (QTL) и генов для маркирования. В расщепляющейся популяции от скрещивания контрастных по изучаемому признаку генотипов яблони [38] была проведена бальная оценка по степени периодичности плодоношения. Были выделены и маркированы QLTs, контролирующие регулярность цветения, составлены генетические карты. Было отмечено также, что предполагаемые гены, инициирующие цветение, не находятся в тех же локусах, что эти QTLs, однако некоторые гены, которые контролируют синтез ауксинов и ГК, совмещены с выявленными локусами отвечающими за периодичность плодоношения. Хотя гены цветения могут не прямым путем определять периодичность плодоношения, регуляция ими синтеза растительных гормонов может быть одной из реакций, ведущих к периодичности [16], [17].

Заключение

Регулярное плодоношение является следствием тонкого баланса между репродуктивным развитием и вегетативным ростом. Любое нарушение этого баланса склонно индуцировать периодичность плодоношения у предрасположенных сортов. У регулярно плодоносящих сортов, даже если и происходит сбой урожая под влиянием внешних стрессоров, то после ситуация быстро нормализуется, и баланс восстанавливается. В противоположность им, периодичные сорта имеют более нестабильное поведение и под воздействием стрессовых факторов выбрасываются из равновесия, продолжая цикличность многие годы, пока не возникнет новое внешнее влияние, которое скорректирует их поведение.

За 40 с лишним лет изучения регуляторных механизмов цветения определены экзогенные (фотопериод, температура, влажность и др.) и эндогенные (содержание углеводов, генотип, фитогормоны) факторы, контролирующие инициацию и развитие цветочных меристем.

Выявлено, что инициация цветочных почек есть результат комплексного взаимодействия физиологических и молекулярных механизмов, которые включают генные сети промоторов и ингибиторов цветения и фитогормональные взаимодействия с ними [29]. За последние 15 лет у родов Malus spp. и Citrus spp. определены и выделены гены, регулирующие цветение и вегетацию. Выявлено, что признак «периодичность плодоношения» является мультилокусным и локусы генов фитогормонов связаны с локусами количественных признаков. Ведутся дальнейшие исследования, для выявления механизмов действия этих генов и фитогормонов, обусловливающих данный признак.

Часть материалов статьи была опубликована в сборнике трудов молодых ученых, аспирантов, соискателей «Научные исследования в Субтропиках России», 2013 год, с. 66—76.

Литература

1. Addicott F.T. and Lyons J.L. Physiological ecology of abscission. In: Shedding of plant parts / ed. by T.T. Kozlowski. NY: Academic Press, 1973. P. 85–124;
2. K.F. Bangerth. (2009). Floral induction in mature, perennial angiosperm fruit trees: Similarities and discrepancies with annual/biennial plants and the involvement of plant hormones. Scientia Horticulturae. 122, 153-163;
3. Chandler W.H. Evergreen orchards. London: Henry Kimpton, 1950;
4. Couranjou J. (1970). Recherches sur les causes génétiques et les mécanismes de l'alternance du prunier domestique (Prunus domestica). I-Mise en évidence de deux caractères de productivité comme facteurs d'alternance. Incidence d'un élément du milieu sur l'expression de l'alternance et sa modification. Annales de l'Amélioration des Plantes. 20, 297-318;
5. Couranjou J. (1978). Recherches sur les causes génétiques et les mécanismes de l'alternance du prunier domestique Prunus domestica L. II-Effet de la charge en fruits d'une partie de l'arbre sur l'induction florale dans le reste de l'arbre, dépourvu de fruits; niveau d'autonomie entre les deux parties selon les cultivars. Physiologie Végétale. 16, 505-520;
6. Masood Khezri, Richard Heerema, Gurreet Brar, Louise Ferguson. (2020). Alternate bearing in pistachio (Pistacia vera L.): a review. Trees;
7. Marcelo Carnier Dornelas, Raquel Luciana Boscariol Camargo, Luciana Harumi Morimoto Figueiredo, Marco Aurélio Takita. (2007). A genetic framework for flowering-time pathways in Citrus spp.. Genet. Mol. Biol.. 30, 769-779;
8. Eaton G.N. (1978). Floral induction and biennial bearing in the cranberry. Fruit Var. J. 32, 58–60;
9. B. M. El-Zeftawi, L. R. Thornton. (1975). Effects of rootstocks and fruit stripping on alternate bearing of Valencia orange trees. Journal of Horticultural Science. 50, 219-226;
10. Tomoya Esumi, Ryutaro Tao, Keizo Yonemori. (2005). Isolation of LEAFY and TERMINAL FLOWER 1 homologues from six fruit tree species in the subfamily Maloideae of the Rosaceae. Sex Plant Reprod. 17, 277-287;
11. Fisher D.V. (1951). Time of blossom bud induction in apricots. Proc. Amer. Soc. Hart. Sci. 58, 19–22;
12. Gardner V.T. Principles of horticultural production. East Lansing: Michigan State Univ. Press, 1966;
13. Goldschmidt E.E. and Monselise S.P. (1977). Physiological assumptions toward the development of a citrus fruiting model. Proc. Intern. Soc. Citriculture. 2, 668–672;
14. Aaron Greenup, W. James Peacock, Elizabeth S. Dennis, Ben Trevaskis. (2009). The molecular biology of seasonal flowering-responses in Arabidopsis and the cereals. Annals of Botany. 103, 1165-1172;
15. E.E. Goldschmidt, A. Samach. (2004). ASPECTS OF FLOWERING IN FRUIT TREES. Acta Hortic.. 23-27;
16. Baptiste Guitton, Jean-Jacques Kelner, Riccardo Velasco, Susan E. Gardiner, David Chagné, Evelyne Costes. (2012). Genetic control of biennial bearing in apple. Journal of Experimental Botany. 63, 131-149;
17. Hanke M., Flachowsky H., Peil A., Hättasch C. (2007). No flower no fruit. Genetic potentials to trigger flowering in fruit trees. Genes, Genomes and Genomics. 1, 1–20;
18. G.V. Hoad. (1978). THE ROLE OF SEED DERIVED HORMONES IN THE CONTROL OF FLOWERING IN APPLE. Acta Hortic.. 93-104;
19. Iwasaki T., Shichijo T., Iba Y. (1962). Studies on the control of alternate bearing in citrus. VI. An investigation on thinning materials for ’Satsuma’ orange. J. Jap. Soc. Hart. Sci. 31, 1–12;
20. Jones W.W., Embleton T.W., Coggins C.W.JR. (1975). Starch content of roots of ’Kinnow’ mandarin trees bearing fruits in alternate years. HortScience. 10, 514;
21. H. Jonkers. (1979). Biennial bearing in apple and pear: A literature survey. Scientia Horticulturae. 11, 303-317;
22. Y. Kobayashi. (1999). A Pair of Related Genes with Antagonistic Roles in Mediating Flowering Signals. Science. 286, 1960-1962;
23. Yoshibumi Komeda. (2004). GENETIC REGULATION OF TIME TO FLOWER INARABIDOPSIS THALIANA. Annu. Rev. Plant Biol.. 55, 521-535;
24. Nobuhiro Kotoda, Masato Wada, Shinnosuke Kusaba, Yuriko Kano-Murakami, Tetsuo Masuda, Junichi Soejima. (2002). Overexpression of MdMADS5, an APETALA1-like gene of apple, causes early flowering in transgenic Arabidopsis. Plant Science. 162, 679-687;
25. Nobuhiro Kotoda, Masato Wada. (2005). MdTFL1, a TFL1-like gene of apple, retards the transition from the vegetative to reproductive phase in transgenic Arabidopsis. Plant Science. 168, 95-104;
26. Nobuhiro Kotoda, Hiroshi Iwanami, Sae Takahashi, Kazuyuki Abe. (2006). Antisense Expression of MdTFL1, a TFL1-like Gene, Reduces the Juvenile Phase in Apple. jashs. 131, 74-81;
27. Nobuhiro Kotoda, Hidehiro Hayashi, Motoko Suzuki, Megumi Igarashi, Yoshimichi Hatsuyama, et. al.. (2010). Molecular Characterization of FLOWERING LOCUS T-Like Genes of Apple (Malus × domestica Borkh.). Plant and Cell Physiology. 51, 561-575;
28. Scott D. Michaels, Edward Himelblau, Sang Yeol Kim, Fritz M. Schomburg, Richard M. Amasino. (2005). Integration of Flowering Signals in Winter-Annual Arabidopsis. Plant Physiol.. 137, 149-156;
29. Scott D Michaels. (2009). Flowering time regulation produces much fruit. Current Opinion in Plant Biology. 12, 75-80;
30. Natalia Muñoz-Fambuena, Carlos Mesejo, M. Carmen González-Mas, Eduardo Primo-Millo, Manuel Agustí, Domingo J. Iglesias. (2011). Fruit regulates seasonal expression of flowering genes in alternate-bearing ‘Moncada’ mandarin. Annals of Botany. 108, 511-519;
31. Monselise S.P., Goldschmidt E.E., Golomb A. (1981). Alternate bearing in citrus and ways of control. Proc. Intern. Soc. Citriculture. 1, 239;
32. S.P. Monselise, E.E. Goldschmidt. (2011). Alternate Bearing in Fruit Trees. Horticultural Reviews. 128-173;
33. Moss G.I., Bevington K.B., Gallasch P.T., El Zefta Wi B.M. (1981). Alternate cropping of Valencia oranges. NSW Dept. Agr. Tech. Bul. 88, 1–27;
34. Francois Parcy. (2005). Flowering: a time for integration. Int. J. Dev. Biol.. 49, 585-593;
35. Leandro Peña, Mar Martín-Trillo, José Juárez, José A. Pina, Luis Navarro, José M. Martínez-Zapater. (2001). Constitutive expression of Arabidopsis LEAFY or APETALA1 genes in citrus reduces their generation time. Nat Biotechnol. 19, 263-267;
36. Lynn Jo Pillitteri, Carol J. Lovatt, Linda L. Walling. (2004). Isolation and Characterization of LEAFY and APETALA1 Homologues from Citrus sinensis L. Osbeck `Washington'. jashs. 129, 846-856;
37. Potter G.F., Sitton B.J., McCann L.P. (1947). The effect of different rates of application of nitrogen in biennial bearing in tung. Proc. Am. Soc. Hart. Sci. 50, 125–130;
38. Vincent Segura, Charles-Eric Durel, Evelyne Costes. (2009). Dissecting apple tree architecture into genetic, ontogenetic and environmental effects: QTL mapping. Tree Genetics & Genomes. 5, 165-179;
39. Singh R.N. (1971). Biennial bearing in fruit trees-accent on apple and mango. Ind. Counc. Agr. Res. Bul. 30;
40. Sparks D. (1975). The alternate fruit bearing problem in pecans. 65th Annu. Proc. Northern Nut Growers Assoc. 145–158;
41. Stewart L., Wheaton T.A., Reese R.L. (1968). ‘Murcott’ collapse due to nutritional deficiencies. Proc. Fla. State Hort. Soc. 81, 15–18;
42. West E.S. and Barnard C. (1935). The alternation of heavy and light crops in the ‘Valencia’ late orange. J. Counc. Sci. Ind. Res. Australia. 10, 215–224;
43. Westwood M.N. Temperate-zone pomology. San Francisco: W.H. Freeman & Co., 1978;
44. Worley R.E. (1971). Effects of defoliation date on yield, quality, nutlet set and foliage regrowth for pecan. HortScience. 6, 446–447;
45. Worley R.E. and Littrell R.H. (1973). Effect of fungicides on fruit quality and control of pecan scab and premature defoliation. J. Amer. Soc. Hart. Sci. 98, 102–105.