Конкурс «Био/Мол/Текст»-2024/2025

Эта работа опубликована в номинации «Свободная тема» конкурса «Био/Мол/Текст»-2024/2025.

Генеральный партнер конкурса — международная инновационная биотехнологическая компания BIOCAD.

---

Партнер номинации — компания SkyGen: передовой дистрибьютор продукции для life science на российском рынке.

---

«Книжный» спонсор конкурса — «Альпина нон-фикшн»

Батрахотоксин — это мощный яд с нейротоксическим и кардиотоксическим действием из группы стероидных алкалоидов. Существует несколько производных батрахотоксина, обладающих практически одинаковыми свойствами (рис. 1). Название этих уникальных ядов произошло от греческого слова βάτραχος, что означает «лягушка». А всё потому, что в течение долгого периода батрахотоксины в позвоночных обнаруживались только у лягушек рода Phyllobates (к которому и относится Листолаз ужасный), но не у сотен других ядовитых животных [1]. На сегодняшний день ученые нашли этот токсин еще у целой группы птиц с острова Новая Гвинея. Но обо всем по порядку.

На чем же основано действие батрахотоксина и его производных?

Довольно давно ученые обратили внимание, что вещество, выделяемое лягушками рода Phyllobates (Листолазы), вызывает онемение после контакта с кожей. При изучении выяснилось, что яд Листолаза ужасного — батрахотоксин — может оказывать свое токсическое действие через натриевые каналы [2] клеток возбудимых тканей (в первую очередь, нервной и мышечной). Потенциал-чувствительные натриевые каналы открываются, реагируя на изменение электрического заряда клетки — деполяризацию мембраны [3]. Причем в покое (когда электрический потенциал равен примерно −70 мВ внутри клетки) они закрыты, а открываются они при деполяризации (когда потенциал приближается к 0) [4]. Уникальность натриевых каналов в том, что именно их открытие запускает первую фазу потенциала действия: быстрое поступление ионов натрия в клетку. Поступая внутрь, положительно заряженные ионы меняют заряд мембраны и вызывают цепную реакцию открытия следующих натриевых каналов. При этом, как только натриевый канал закрывается, начинается работа калиевого канала, через который из клетки наружу при его открытии выходят ионы калия [5]; а затем включается работа натрий-калиевой АТФазы, которая на два иона калия, перемещаемых внутрь клетки, выводит наружу три иона натрия. Оба последних процесса обеспечивают восстановление отрицательного заряда на внутренней поверхности мембраны и называются реполяризацией. Смена локального заряда на мембране при процессах деполяризации-реполяризации лежит в основе распространения нервного импульса по нервному волокну до момента высвобождения нейромедиатора в синапсе в норме [3].

Батрахотоксин даже в незначительных концентрациях может вклиниваться в работу натриевых каналов (именно из-за этой особенности его часто используют в качестве биохимического инструмента при их изучении). Молекулы токсина, подобно камню в шестеренках механизма, проникают прямо в натриевый канал и стабилизируют его в открытой конформации, не позволяя закрыться [6]. Грубо говоря, батрахотоксин действует как стент, удерживающий открытыми натриевые каналы. При этом подавляется как быстрая, так и медленная инактивация каналов — а, значит, канал постоянно пропускает ионы натрия в клетку [7]. Конечно, это деполяризует мембрану и не дает восстановиться ионному потенциалу. Постоянная деполяризация приводит к увеличению проницаемости для кальция, а это, в свою очередь, дополнительно вызывает гиперактивность в синапсах, сильные сокращения скелетных мышц и опасные для жизни аритмии в сердце. Самое грустное и одновременно восхитительное в этом то, что для проявления симптомов достаточно нарушения работы лишь нескольких процентов от общего числа натриевых каналов. Этот факт еще сильнее увеличивает силу летального действия токсина.

В чем же уникальность взаимодействия батрахотоксина с натриевым каналом? Как этому яду удается быть эффективнее всех остальных?

Этот яд уникален тем, что представляет собой небольшую молекулу, легко проникает через кожу и очень, очень эффективен. В среднем в организме одной особи Phyllobates terribilis содержится лишь около одного миллиграмма яда, чего достаточно, чтобы убить 10 000 мышей, от 10 до 20 человек или двух африканских слонов [8]. На данный момент батрахотоксин считается самым мощным из всех токсинов натриевых каналов. Многие высокотоксичные малые молекулы, вырабатываемые самыми разными видами растений и животных, связываются в среднем с одним из шести специфических рецепторных участков натриевых каналов и парализуют хищников и добычу [9], [10]. Результаты изучения батрахотоксина показали, что для него существует свой рецепторный участок, имеющий два подучастка (на рис. 2 они обозначены как участок IIB1 и участок IIB2). Геометрия двойного сайта связывания и расстояние между его подучастками создают идеальную структуру для высокоаффинного связывания молекул батрахотоксина и, как следствие, к необратимой активации натриевых каналов. Уникальные двойные рецепторные участки и лежат в основе исключительно мощных и многогранных эффектов токсина, т.к. непосредственно влияют на поток ионов через открытые токсином каналы, тогда как другие яды натриевых каналов только модулируют ионные токи через них [11], [12].

Как же способность батрахотоксина к высокоаффинному связыванию отразилась на знании человечества о его токсичности?

Итак, впервые батрахотоксины были выделены из колумбийской лягушки-дротика (так назвали Phyllobates terribilis аборигены), а уже затем обнаружены у некоторых воробьиных птиц Новой Гвинеи. Коренные жители острова на протяжении столетий знали, что некоторые виды птиц неприятны на вкус, а их мясо вызывает сильное отравление. И вот, наконец, тридцать лет назад было обнаружено, что эти виды содержат мощное нейротоксичное соединение — уже знакомый нам батрахотоксин. Ни одна из групп позвоночных не может самостоятельно синтезировать токсины, поэтому токсичные позвоночные получают их из пищевых источников. Получается, что и лягушки, и птицы накапливают столь высокие концентрации батрахотоксина... из-за своей диеты. Это можно доказать небольшим экспериментом — если вырастить лягушку-дротика в неволе, то животное совсем не будет ядовитым [1].

В дикой же природе основными поставщиками токсина являются маленькие жуки Choresine из семейства Melyridae (рис. 3). Содержащиеся внутри них громадные концентрации батрахотоксинов позволяют рассматривать их как источник яда для птиц Новой Гвинеи. Анализ содержимого желудков птиц выявил жуков Choresine в их рационе (конечно же, вместе с множеством других мелких членистоногих). А поскольку семейство Melyridae космополитично, родственники Choresine в колумбийских дождевых лесах Южной Америки являются источником батрахотоксинов, обнаруженных у ядовитых лягушек Phyllobates этого региона. Токсичность последних так велика, что южноамериканские индейцы со склонов Анд в Колумбии использовали таких лягушек для обработки наконечников своих стрел (рис. 4). Причем было несколько способов нанести яд на наконечник, но даже самого простого потирания о кожу лягушки было достаточно, чтобы сделать стрелу смертельной. Сами индейцы обрабатывали стрелы в перчатках из листьев, чтобы случайно не задеть ядовитую лягушку голой кожей [12].

Поиск токсичных птиц среди пернатых, обитающих в Новой Гвинее, показал, что за счет вариабельности содержания токсина в организме птицы и за счет существования разновидностей батрахотоксина токсичных видов птиц в действительности больше, чем считалось ранее. Некоторые птицы содержат лишь незначительное количество одного из производных яда, тогда как другие могут содержать до шести разновидностей батрахотоксина, еще и в больших концентрациях (рис. 5) [13].

При этом и те, и другие птицы как-то приспособились к наличию токсина внутри организма — сами же они от него не погибают. Накапливается батрахотоксин в основном в перьях и коже — в таких органах, как сердце и печень концентрации вещества пренебрежимо малы. Согласитесь, мудро хранить токсин, смертельный для мышечных клеток, где-то вдалеке от них — он скапливается в многогранулярных телах эпидермальных клеток, обычно запасающих кератин или липидный секрет [14]. Вероятно, чтобы доставить батрахотоксин из пищеварительного тракта в кожу, необходимо сохранять его неактивным для защиты внутренних органов (или сделать каналы нечувствительными к токсину). Также можно предположить, что каналы, в основном экспрессирующиеся во внутренних органах, могут нормально существовать и без резистентности к батрахотоксину (потому что они не подвергаются его воздействию), и только каналы, которые могут столкнуться с ядом (например, скелетные мышцы около кожи), нуждаются в защитных механизмах.

И тогда очень логичным будет вопрос — почему же этот самый секрет кожи смертелен для человека, но безвреден для маленькой лягушки и целого острова птиц?

Начнем издалека. Справляться с ядами можно разными способами. Например, лягушка-бык накапливает яд, очень похожий на батрахотоксин — сакситоксин. Этот яд связывается в организме животного с транспортным белком саксифилином, гомологом трансферрина [14]: этот белок может связывать молекулу токсина из плазмы крови. Находящийся в связи с этим белком саксифилин не способен проявлять никакую активность, и тем более не может взаимодействовать с натриевыми каналами, а значит — безопасен для организма. Казалось бы, что-то подобное должно быть предусмотрено природой и для батрахотоксина. Однако современные исследования не выявили таких замечательных «белков-губок», впитывающих батрахотоксин. И пока этот способ борьбы с ядом не открыт, остается шанс, что организмы используют совершенно новый, неоткрытый механизм защиты от батрахотоксина. И раз и птицы, и лягушки вполне себе неплохо живут при больших концентрациях яда в организме, значит, такой механизм есть. Это довольно занятная адаптация — несколько мутаций в натриевых каналах. Учитывая, что мишенью батрахотоксина является именно натриевый канал, с точки зрения природы будет логично внести в него небольшие изменения, не нарушающие функцию канала, но при этом мешающие яду взаимодействовать с ним.

Эти изменения являются мутациями в аминокислотной последовательности гена SCN4A, кодирующего α-субъединицу потенциал-чувствительного натриевого канала 4 типа, находящегося в основном в скелетных мышцах [15]. У исследованных птиц было выявлено две общие мутации в гене SCN4A (рис. 6), приводящие к двум аминокислотным заменам: аспарагиновой кислоты (D) на аспарагин (N) (D1050N) и серина (S) на пролин (P) (S1568P). Эти замены были найдены и у нетоксичных видов семейства птиц Pachycephalidae, которые, впрочем, не были полностью протестированы на наличие батрахотоксина, а значит, где-то в глубине своих перьев могут быть ядовитыми. Также у большинства птиц были выделены и другие специфические, характерные только для них мутации всё в том же гене, но уже в других аминокислотах. Таким образом, у птиц Новой Гвинеи защитные изменения гена натриевых каналов совсем незначительные и чаще всего затрагивают лишь пару-тройку аминокислот. Однако даже такие маленькие изменения очень отражаются на структуре канала. Из-за этого после закрепления мутации шанс батрахотоксина или его производных связаться с каналом совсем небольшой. Ранее были выявлены мутации у лягушек Phyllobates [16], обеспечивающие их устойчивость к батрахотоксину.

После того, как ученые сравнили мутации для натриевого канала двух видов лягушек и нескольких видов островных птиц, выяснились следующие факты. Во-первых, мутации были обнаружены в разных позициях, но в одном гене — SCN4A. Выходит, адаптации, прошедшие эволюционные преобразования, на молекулярном уровне обеспечивают ауторезистентность к батрахотоксину в двух отдаленно родственных группах позвоночных. Во-вторых, разные множественные мутации в канале могут обеспечивать толерантность к токсинам у разных видов ядовитых птиц.

Результаты исследования роли мутаций гена SCN4A в устойчивости к батрахотоксину открыли перспективы для новых исследований: при сравнении эффектов мутаций птиц в предсказанной модели крысиного гена SCN4A (который уже использовали для исследования ядовитых лягушек-дротиков) было обнаружено, что общая мутация S1568P и специфичная для птиц вида Ifrita kowaldi F303L снизили сродство связывания со всеми производными батрахотоксина [13]. Специфичная мутация у птиц Pitohui dichrous E1262Q снизила сродство связывания с батрахотоксином и его производным — батрахотоксином A. Это говорит о том, что мутации, обнаруженные в гене SCN4A ядовитых птиц, могут придавать устойчивость к яду каналам, обнаруженным и у крыс, и у людей.

Эта история — яркий пример того, как незначительные мутации генов стали причиной появления поразительной суперспособности отдельных живых организмов. Естественным путем это происходит благодаря «эволюционной гонке вооружений» [10]. Однако причинами изменений живых организмов в настоящее время являются не только движущие силы эволюции; всё большую и большую роль в этом процессе желают играть ученые-биологи. Кто знает, может быть, с помощью науки в ближайшем будущем и у человечества получится приобрести устойчивость к одному из самых сильных на планете ядов.

Литература

1. John P. Dumbacher, Avit Wako, Scott R. Derrickson, Allan Samuelson, Thomas F. Spande, John W. Daly. (2004). Melyrid beetles ( Choresine ): A putative source for the batrachotoxin alkaloids found in poison-dart frogs and toxic passerine birds. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.. 101, 15857-15860;
2. Wexler P. Encyclopedia of Toxicology (Third Edition). Academic Press, 2014. P. 371–373;
3. Формирование мембранного потенциала покоя;
4. Калиевый канал in silico;
5. 12 методов в картинках: нейробиология;
6. О чем не знал Гальвани: пространственная структура натриевого канала;
7. Wexler P. Encyclopedia of Toxicology (Fourth Edition). Academic Press, 2023;
8. Rocio K. Finol-Urdaneta, Jeffrey R. McArthur, Marcel P. Goldschen-Ohm, Rachelle Gaudet, Denis B. Tikhonov, et. al.. (2019). Batrachotoxin acts as a stent to hold open homotetrameric prokaryotic voltage-gated sodium channels. Journal of General Physiology. 151, 186-199;
9. Тетродотоксин — история элегантного убийцы;
10. Яды — высокоточное оружие: компьютерное исследование природных нейротоксинов;
11. Gilliland K. Frogs of the World. Volume 2. // In: Nature's Wonders Frogs of the World;
12. Lige Tonggu, Goragot Wisedchaisri, Tamer M. Gamal El-Din, Michael J. Lenaeus, Matthew M. Logan, et. al.. (2024). Dual receptor-sites reveal the structural basis for hyperactivation of sodium channels by poison-dart toxin batrachotoxin. Nat Commun. 15;
13. Kasun H. Bodawatta, Haofu Hu, Felix Schalk, Jan‐Martin Daniel, Gibson Maiah, et. al.. (2024). Multiple mutations in the Nav1.4 sodium channel of New Guinean toxic birds provide autoresistance to deadly batrachotoxin. Molecular Ecology. 33;
14. Tien-Jui Yen, Marco Lolicato, Rhiannon Thomas-Tran, J. Du Bois, Daniel L. Minor. (2019). Structure of the saxiphilin:saxitoxin (STX) complex reveals a convergent molecular recognition strategy for paralytic toxins. Sci. Adv.. 5;
15. L. Peltonen, Y. Arieli, R. Harjula, A. Py�rnil�, J. Marder. (2000). Local cutaneous water barrier in cold- and heat-acclimated pigeons (Columba livia) in relation to cutaneous water evaporation. J. Morphol.. 246, 118-130;
16. Rebecca D Tarvin, Juan C Santos, Lauren A O'Connell, Harold H Zakon, David C Cannatella. (2016). Convergent Substitutions in a Sodium Channel Suggest Multiple Origins of Toxin Resistance in Poison Frogs. Molecular Biology and Evolution. 33, 1068-1080.