Конкурс «Био/Мол/Текст»-2020/2021

Эта работа опубликована в номинации «Академия & Бизнес» конкурса «Био/Мол/Текст»-2020/2021.

---

Генеральный партнер конкурса — ежегодная биотехнологическая конференция BiotechClub, организованная международной инновационной биотехнологической компанией BIOCAD.

---

Спонсор конкурса — компания SkyGen: передовой дистрибьютор продукции для life science на российском рынке.

---

Спонсор конкурса — компания «Диаэм»: крупнейший поставщик оборудования, реагентов и расходных материалов для биологических исследований и производств.

---

«Книжный» спонсор конкурса — «Альпина нон-фикшн»

У всех увлеченных людей есть потребность в удовлетворении своего любопытства. Некоторым из нас везет — это можно делать в рабочее время за счёт денег налогоплательщиков или потребителей. На первый взгляд такой процесс с непредсказуемым результатом может показаться неэффективным расходом ресурсов. Но это не так. Технологические прорывы возникают только тогда, когда кто-то рискует, дает волю своей фантазии и начинает использовать ресурсы неожиданным образом. При этом если результат Его Величества Эксперимента известен заранее, то это уже не эксперимент, а копирование чужой идеи. Замечу, что творческую деятельность сложно выполнять по приказу. «Иванов, до 31 числа жду от тебя пять озарений», — звучит смешно, но реально. Бóльшая часть научных открытий никакой прямой пользу обществу не несет. Фундаментальная наука создает основу для прикладной; конечный результат — статья в рецензируемом научном журнале, то есть идея с зафиксированным приоритетом. Прикладная же наука скорее использует эти статьи в попытке найти им применение; конечный результат — патент, то есть защищенный от копирования вариант использования идеи. Патенты могут быть востребованы бизнесом для создания коммерчески доступных продуктов, которые удовлетворяют нужды потребителей и приумножают вложенный капитал. Получается пирамида «ворох идей → горсть применений → щепотка продуктов». Не идеально, но ничего эффективнее нет — только так идеи становятся коммерчески доступными продуктами [1]. В этой заметке рассмотрим один из успешных примеров, (слегка) изменивших мир.

А в чем проблема?

В 2004 году моя сестра родила сына с синдромом Дауна. Ребенка не стало через шесть дней после рождения. Это был опустошающий опыт для всей нашей семьи. Я основал компанию Natera, потому что верю, что все семьи заслуживают доступа к технологиям, которые предлагают раннее обнаружение генетических заболеваний.

Качество и продолжительность жизни зависит от генетических особенностей индивидуума и давления внешней среды. Некоторые генетические нарушения могут настолько сильно ухудшить физическое, душевное и социальное благополучие человека, что считаются медицинскими показаниями к искусственному прерыванию беременности.

В ядре человеческой клетки в норме 23 пары хромосом. Одну хромосому из каждой такой пары мы получаем от папы, а вторую — от мамы. А потом передаем своим детям 23 хромосомы, скомпонованные из отцовских и материнских хромосом. А второй родитель добавляет другой перемешанный вариант 23 хромосом. В результате встречи двух гамет (сперматозоида и яйцеклетки) может образоваться эмбрион с 23 парами хромосом. Но иногда что-то идет не так, и у нового организма общее число хромосом отличается от 46-и. Такое нарушение называют анеуплоидией (строго говоря, это «некратное увеличение набора хромосом»). В самых тяжелых случаях эмбрион в принципе не будет развиваться, имплантации не произойдет — и женщина даже не заметит признаков не начавшейся беременности [2]. Иногда беременность наступит, но преждевременно прервется — произойдет выкидыш [3]. А при некоторых анеуплоидиях (например, синдроме Дауна) эмбрион разовьется, и беременность может завершиться родами. Часть родителей отказывается от детей с особенностями развития, часть посвящает себя уходу за ребенком. Современные методы позволяют диагностировать анеуплоидии на ранних стадиях развития плода, что, повторюсь, является медицинским показанием к искусственному прерыванию беременности. Результат такого анализа может стать основой для этически очень непростого, но осознанного решения родителей о прекращении или продолжении беременности. Отмечу, что синдром Дауна — далеко не единственный результат анеуплоидий. Также, например, возможно развитие синдромов Эдвардса, Патау и других генетических отклонений от условной нормы.

Как диагностировать анеуплоидии?

Достоверно диагностировать анеуплоидию можно только определив число хромосом в геноме плода. Но как безопасно получить биоматериал? Человеческий эмбрион развивается в амниотической полости. Этот мешок окружен плодными оболочками, внутренняя часть которых называется амнионом. Кстати говоря, в русском языке есть выражение «в рубашке родился». Такой «рубашкой» (рис. 1) называют неразорвавшиеся во время родов плодные оболочки. Эмбрион плавает в околоплодных водах (амниотической жидкости), в которой есть отмершие клетки плода. В результате анализа генома этих клеток можно посчитать число хромосом нового организма.

Амниотическую жидкость для анализа получают в результате амниоцентеза. Такая инвазивная процедура заключается в проколе амниотической оболочки и заборе околоплодных вод для анализа. Надо отметить, что амниоцентез может провоцировать выкидыши. Вероятность такого неблагополучного исхода беременности составляет примерно 30 случаев на 10 000 процедур [4]. Существуют и другие способы инвазивной пренатальной диагностики с сопоставимыми рисками. При этом в среднем из 10 000 новорожденных 13 появляются на свет с синдромом Дауна [5]. Это значит, что, грубо говоря, инвазивная диагностика скорее приведет к выкидышу, чем выявит анеуплоидии плода.

Как неинвазивно диагностировать анеуплоидии?

В 1969 году в крови беременной женщины обнаружили клетки, содержащие Y-хромосомы [6]. В результате родов на свет появился мальчик. Таким образом, стало понятно, что клетки плода могут находиться в крови беременной женщины. Тем не менее таких клеток мало, что затрудняет разработку рутинных диагностических тестов [7]. Затем в 1997 году фетальную (от лат. fetus — плод) ДНК обнаружили в плазме крови беременных женщин [8]. Отмечу, что плазма — это жидкая бесклеточная фракция крови, в которой взвешены форменные элементы, то есть клетки крови. Таким образом, в результате такой малоинвазивной процедуры, как забор крови беременной женщины, можно исследовать ДНК плода. Тем не менее существующий на начало 2000-х годов уровень развития технологий не предполагал рутинного решения для диагностики анеуплоидий [9].

Исследование фетальной ДНК из свободной от клеток фракции крови, то есть плазмы, стало доступным за счет появления методов высокопроизводительного секвенирования. Существуют разные способы выполнения такого анализа. Запатентованный компанией Natera метод вошел в широкую клиническую практику [16]. Для исследования внеклеточную ДНК выделяют из плазмы крови беременной женщины. Затем некоторые фрагменты этой ДНК амплифицируют и секвенируют. Параллельно то же самое делают с геномной ДНК мамы и папы. В результате получают массивы данных высокопроизводительного секвенирования, в которых зашифрована информация о десятках тысяч однонуклеотидных полиморфизмов (ОНП). Эти большие данные обрабатывают при помощи соответствующего алгоритма [17].

В методе NATERA рассматривают только два самых частых варианта ОНП. Для упрощения обозначим первый вариант ОНП символом «А», а второй — символом «В». Если секвенировать один человеческий организм, то возможно три варианта сочетаний ОНП из двух хромосом: АА, АВ и ВВ. Для каждого ОНП измеряют частоту встречаемости ОНП «А», то есть фракцию «А». Для сочетания АА это значение будет равно 100%, для сочетания АВ — 50%, а для сочетания ВВ — 0%. Теперь усложним задачу — пусть в образце есть ДНК из двух разных организмов. Тогда, если в обоих организмах ОНП присутствует в одинаковом варианте АА, то частота А составит 100%. Но возможна и такая ситуация, что в одном организме есть сочетание АА (на двух хромосомах одинаковый ОНП — «А»), а в другом — АВ (на одной хромосоме ОНП «А», а на второй — «В»). Тогда общая фракция «А» будет меньше 100%. Это значение зависит от соотношения между количеством ДНК разных организмов в образце. Если материнской ДНК 99%, а фетальной — 1%, то разница будет незаметна для человеческого глаза. А если материнской ДНК 50%, и фетальной ДНК тоже 50%, то частота «А» в смеси составит 75%. И так далее — возможны разные сочетания вариантов АА, АВ, ВВ из двух разных организмов. Подобную ситуацию можно проиллюстрировать графиком (рис. 2 и 3). Исследуемые ОНП располагают по абсциссе согласно месту локализации в геноме, фракции «А» для каждого ОНП откладывают по ординате. Если оба организма содержат нормальное число хромосом, то получится что-то подобное рисунку 2. Вклад фетальной ДНК приводит к распределению точек в отдельные кластеры-отпечатки, которые можно использовать для определения числа копий хромосомы.

А теперь представим ситуацию, когда одна из хромосом плода продублирована. Тогда получится что-то подобное рисунку 3.

На рисунке 3 видно, что паттерн распределение частот «А» для ОНП 13-й хромосомы отличается от паттерна распределения фракции «А» для ОНП 18-й, 21-й и Х-хромосомы. Это значит, что у плода есть три 13-е хромосомы. Такое состояние называют синдромом Патау, при котором наблюдают тяжелые врожденные пороки. Следует отметить, что при малой доле фетальной ДНК во внеклеточной ДНК плазмы крови беременной женщины паттерны распределения фракции «А» для ОНП разных хромосом неразличимы для человеческого глаза при анеуплоидии у плода. Невидимые глазу искажения распределения фракций «А» можно различить при помощи автоматизированной обработки данных на основе разработанного алгоритма [18]. Таким образом, неинвазивная процедура (забор крови беременной женщины) позволяет выявить анеуплоидии у плода.

А что с коммерциализацией?

Сейчас услугой компании Natera воспользовались более двух миллионов беременных женщин из нескольких десятков стран. Стоимость анализа составляет сотни долларов, что доступно для значимой части целевой аудитории продукта. Число проводимых тестов с каждым годом растет, то есть рынок далек от насыщения. Запатентованная технология неинвазивного выявления анеуплоидий у плода во время беременности — одна из двух основных приносящих доход продуктов компании Natera. За первые три месяца 2020 года общий доход компании составил 94 миллиона долларов, валовая прибыль — 49 миллионов долларов. То есть эта динамично развивающаяся компания удовлетворяет запросы всё большего числа потребителей за счет превращения воздушных идей научных сотрудников в приземленный материальный продукт.

Заключение

Эта заметка — краткая справка по одному из способов неинвазивной диагностики анеуплоидий у плода. Но сколько фундаментальных и прикладных исследований понадобилось, чтобы из идей-фантазий получилось что-то материальное? Много. Знали ли авторы этих работ, что получится в результате? Не знали. Сколько было неудачных попыток превращения идей в коммерческий продукт? Неизвестно. Для успеха скорее необходима плодотворная среда, в которой комфортно сосуществуют фантазеры и жесткие прагматики. Для каких-то работ исход сложно предсказать, нужно включать фантазию и не бояться ошибаться. Но чем четче очертания конечного результата, тем проще привлечь капитал, которым рискуют в надежде приумножить. Сухой расчет необходим для оценки необходимых вложений и вероятных доходов. Чем приземленнее такой расчет, тем меньше рисков потерять привлеченный капитал и тем больше вероятность ситуации Win-Win для всех причастных.

Литература

1. Наукоемкий бизнес: как и почему фармацевтические компании сотрудничают с учеными и стартаперами?;
2. Verlinsky Y, Tur-Kaspa I, Cieslak J, Bernal A, Morris R, et. al.. (2005). Preimplantation testing for chromosomal disorders improves reproductive outcome of poor-prognosis patients. Reproductive BioMedicine Online. 11, 219-225;
3. Chan-Wei Jia, Li Wang, Yong-Lian Lan, Rui Song, Li-Yin Zhou, et. al.. (2015). Aneuploidy in Early Miscarriage and its Related Factors. Chinese Medical Journal. 128, 2772-2776;
4. L. J. Salomon, A. Sotiriadis, C. B. Wulff, A. Odibo, R. Akolekar. (2019). Risk of miscarriage following amniocentesis or chorionic villus sampling: systematic review of literature and updated meta‐analysis. Ultrasound Obstet Gynecol. 54, 442-451;
5. Gert de Graaf, Frank Buckley, Brian G. Skotko. (2015). Estimates of the live births, natural losses, and elective terminations with Down syndrome in the United States. Am. J. Med. Genet.. 167, 756-767;
6. Janina Walknowska, FelixA. Conte, MelvinM. Grumbach. (1969). PRACTICAL AND THEORETICAL IMPLICATIONS OF FETAL/MATERNAL LYMPHOCYTE TRANSFER. The Lancet. 293, 1119-1122;
7. Y.M. D. LO. (2003). Fetal DNA in Maternal Plasma/Serum: The First 5 Years. Pediatric Research. 53, 16-17;
8. Y M Dennis Lo, Noemi Corbetta, Paul F Chamberlain, Vik Rai, Ian L Sargent, et. al.. (1997). Presence of fetal DNA in maternal plasma and serum. The Lancet. 350, 485-487;
9. Y. M. Dennis Lo, Rossa W. K. Chiu. (2007). Prenatal diagnosis: progress through plasma nucleic acids. Nat Rev Genet. 8, 71-77;
10. 454-секвенирование (высокопроизводительное пиросеквенирование ДНК);
11. M. Ronaghi. (1998). DNA SEQUENCING:A Sequencing Method Based on Real-Time Pyrophosphate. Science. 281, 363-365;
12. James M. Heather, Benjamin Chain. (2016). The sequence of sequencers: The history of sequencing DNA. Genomics. 107, 1-8;
13. 12 методов в картинках: секвенирование нуклеиновых кислот;
14. Нанопоровое секвенирование: на пороге третьей геномной революции;
15. M. Ronaghi. (1998). DNA SEQUENCING:A Sequencing Method Based on Real-Time Pyrophosphate. Science. 281, 363-365;
16. Wendy DiNonno, Zachary Demko, Kimberly Martin, Paul Billings, Melissa Egbert, et. al.. (2019). Quality Assurance of Non-Invasive Prenatal Screening (NIPS) for Fetal Aneuploidy Using Positive Predictive Values as Outcome Measures. JCM. 8, 1311;
17. Carole Samango-Sprouse, Milena Banjevic, Allison Ryan, Styrmir Sigurjonsson, Bernhard Zimmermann, et. al.. (2013). SNP-based non-invasive prenatal testing detects sex chromosome aneuploidies with high accuracy. Prenat Diagn. 33, 643-649;
18. Megan P. Hall, Matthew Hill, Bernhard Zimmermann, Styrmir Sigurjonsson, Margaret Westemeyer, et. al.. (2014). Non-Invasive Prenatal Detection of Trisomy 13 Using a Single Nucleotide Polymorphism- and Informatics-Based Approach. PLoS ONE. 9, e96677.