Конкурс «Био/Мол/Текст»-2021/2022

Эта статья участвовала в конкурсе «Био/Мол/Текст»-2021/2022 в номинации «Свободная тема» и будет опубликована в журнале «Наука и жизнь».

Партнер номинации — компания SkyGen: передовой дистрибьютор продукции для life science на российском рынке.

---

Генеральный партнер конкурса — международная инновационная биотехнологическая компания BIOCAD.

---

Генеральный партнер конкурса — компания «Диаэм»: крупнейший поставщик оборудования, реагентов и расходных материалов для биологических исследований и производств.

---

«Книжный» спонсор конкурса — «Альпина нон-фикшн»

Первооткрыватели

Слово «гумус» (humus) родом из Древнего Рима — тогда оно означало просто «почва». Но интерес к органическому веществу почвы возник уже тогда. Римские авторы трактатов по сельскому хозяйству писали, что некоторые почвы, которые они называли «жирными» (pin-guis), отличаются более высоким плодородием. А еще о том, что можно добавить в почву навоз, и она станет жирнее, что бы это ни значило.

У знаменитого Вергилия кроме эпических стихов есть поэма «Георгики» — по сути дела, рифмованный учебник по сельскому хозяйству для начинающих. Там есть строки [1]:

Почву жирную мы, наконец, и таким отличаем
Способом: если в руках ее мять, не становится пылью,
Но наподобье смолы прилипает, клейкая, к пальцам.

Историк и писатель Плиний Старший был не согласен с таким способом определения «жирности» почвы [2]:

... не обязательно жирна, клянусь Геркулесом, земля, пристающая к пальцам: это доказывает глина

Звучит не очень научно, но римляне явно понимали, что почвы различаются чем-то очень важным, хотя природа этой «жирности» была им неизвестна.

Во второй половине XVIII века развиваются идеи о том, что почва образуется из органических остатков. Ломоносов писал, что чернозем «произошел от согнития животных и растущих тел со временем» (эту фразу потом будут активно цитировать целые поколения российских почвоведов). Гумусом начинают называть остатки растений и животных, которые разлагаются в почве. В 1786 году немецкий ученый Франц Карл Ахард (Ашар) обработал щелочной экстракт из торфа серной кислотой и получил в колбе некий темный осадок (рис. 1). С этого момента слово «гумус» начинает означать органическое вещество, которое можно выделить из почвы таким методом.

Состав гумуса долго оставался неизвестным. Его воспринимали как загадочный «сок земли», который служит источником плодородия почвы. Почти полвека властвовала гумусовая теория питания растений Валлериуса и Тэера: они считали, что растения строят свои тела из органического вещества почвы. В начале XIX века гумус изучали швед Якоб Берцелиус, голландец Геррит Ян Мульдер, немец Карл Шпренгель. Последний довольно скептически относился к идее, что растения питаются углеродом из почвы. В 1840 году вышла книга Юстуса Либиха «Сельскохозяйственная химия», которая окончательно похоронила гумусовую теорию питания растений, и интерес к гумусу на некоторое время угас.

Золотой век гумуса

В конце XIX века появляется новая наука — почвоведение. Гумусом снова начинают интересоваться, но уже не с агрономической, а с фундаментально-научной точки зрения. В XX веке «гумус» становится одним из главных слов для почвоведов в СССР и Европе.

Они изучали те вещества, которые когда-то выделил Франц Карл Ашар. Метод немного изменили, но сам принцип — щелочная экстракция из почвы и осаждение сильной кислотой — остался прежним. Два основных вопроса, на которые хотелось найти ответ: из чего состоит гумус и как он образуется.

Определили его элементный состав: углерода 53–58%, водорода 3–4%, азота 3–5%, кислорода 31–40%. Соотношение оказалось похожим в разных почвах — значит, эти вещества довольно универсальны.

По соотношению углерода и водорода можно примерно определить, из каких структурных частей состоит вещество: больше водорода — углеродные цепочки, меньше водорода — циклические соединения. Присутствие кислорода усложняло задачу, но все равно было ясно, что в гумусе есть много циклических или ароматических единиц.

Обработали сильными окислителями — получили мономеры лигнина и флавоноидов (вещества растительного происхождения с большим количеством бензольных колец) — значит, в гумусе точно есть ароматические ядра.

После кислотного гидролиза гумуса получили аминокислоты и сахара — значит, есть цепочки белков и полисахаридов.

Эксклюзионная хроматография и метод динамического рассеяния света позволили определить размеры молекул в смеси. Оказалось, что масса молекул гумуса составляет до сотен тысяч дальтон — очень крупные соединения.

Когда появился метод радиоуглеродного датирования, попробовали определить возраст гумуса. Получились сотни или даже тысячи лет [3]. Значит, гумусовые вещества очень устойчивы к разложению? Иначе как бы они могли пролежать тысячи лет в населенной микроорганизмами почве, где органика разлагается довольно быстро?

Из грязи в князи: теория гумификации

В итоге у почвенных химиков сложилась такая картина образования гумуса. Мертвые части растений падают на поверхность почвы и разлагаются до низкомолекулярных соединений. Эти простые вещества потом постепенно конденсируются и превращаются в новые устойчивые макромолекулы — гумус. Почти то же «согнитие растущих тел» Ломоносова, только после «согнития» — сборка новых молекул из результатов разложения. Этот процесс был назван гумификацией, или «вторичным синтезом»: имелось в виду, что первичный синтез происходит в телах живых организмов, а вторичный — в почве. В химическом смысле гумусовые вещества представляли как гетерополимеры с «ядром» из ароматических колец и гетероциклов, и «периферией» — углеводородными цепочками с карбоксильными, фенольными, спиртовыми, амидными и другими функциональными группами. Конкретных формул этих веществ определить не удавалось, но их пытались предположить на основе состава и свойств гумусовых веществ. Получались, например, такие, как на рисунке 2 [4].

Конечно, предполагалось, что в почве есть и обычные органические вещества. Но они либо быстро разлагаются, либо постепенно превращаются в гумус. А гумус — стабильная, долгоживущая часть почвенной органики.

Король почвы

На протяжении XX века практически все положительные свойства почвы для сельского хозяйства и природы связывали с гумусом. Основная позиция была: чем больше гумуса, тем лучше почва.

Ему приписывали главную роль в обеспечении плодородия. Только уже не как источника углерода для растений (теорию гумусового питания давно отвергли) а как кладовой минеральных веществ. Считалось, что молекулы гумусовых веществ за счет больших размеров и множества функциональных групп отвечают за обменные процессы в почве. Они поглощают азот, фосфор, калий из раствора, а потом постепенно отдают их во внешнюю среду, где их потребляют корни растений.

Гумус считали клеем, который соединяет частички почвы друг с другом. Так образуется структура почвы, которая лучше удерживает влагу и противостоит эрозии. Можно вспомнить липнущую к рукам «жирную» почву из римских трактатов: римляне действительно имели в виду почву, богатую органическим веществом.

Итак, ключевые мысли теории гумусообразования [5]:

• Гумус — это очень устойчивые высокомолекулярные органические вещества.
• Гумус — специфически почвенная группа веществ.
• Гумусовые вещества медленно образуются в почве из продуктов разрушения растительных остатков.
• От содержания гумуса зависит плодородие и качество почвы.

Вплоть до начала XXI века эта теория оставалась доминирующей. Она присутствовала во всех учебниках и курсах по химии почв, в том числе в тех, по которым учился автор этой статьи в конце 2000-х.

Против гумуса

Но потихоньку накапливались факты, которые плохо согласуются с теорией гумусообразования.

Оказалось, что если обработать кислотой щелочную вытяжку, можно выделить гумус не только из почвы. Примерно такие же вещества выделяются из донных осадков (сапропеля), торфа (что, собственно, впервые сделал сам открыватель гумуса — Ф.К. Архард), компоста. Но ведь гумус — это продукт особых, специфически почвенных процессов? В других средах образование гумуса происходить не должно.

Идея «согнития растущих тел» оказалась не совсем верной. Bolinder с соавторами изучали изотопный состав органического вещества в почве на кукурузном поле [6]. Кукуруза — это C₄-растение, она накапливает больше изотопа углерода ¹³С. Измерив содержание этого изотопа в почве до и после посадки кукурузы, можно определить, сколько углерода из нее поступило в почву. Поступило его довольно много. Но саму кукурузу при этом убирали на урожай, то есть углерод из стеблей и листьев в почву не попадал! Значит, главный источник органических веществ в почве — это не опад растений, а их корни. И, как выяснилось позже, даже не отмирающие корни, а их выделения [7]. Получается, что в почву в основном поступают сразу простые, низкомолекулярные вещества.

Высокая стабильность гумуса тоже оказалась под вопросом. После вспашки целины или вырубки леса содержание гумуса в почве быстро снижается, иногда в несколько раз. Это довольно странно для сверхустойчивого вещества возрастом в сотни лет. Если в почву внести изотопную метку (остатки растений, обогащенных изотопом ¹⁴С), то этот углерод очень быстро обнаруживается в гумусовых веществах, а уже через тридцать лет — почти пропадает [8]. Значит, образование и разрушение гумуса занимает всего несколько лет, а совсем не сотни и тысячи?

С размерами молекул гумусовых веществ тоже было непонятно: они различались в десятки, сотни, а иногда и в тысячи раз.

В 2001 году Alessandro Piccolo опубликовал статью, в которой обобщил данные по химии гумуса. Он предположил, что гумусовые вещества — это не огромные полимеры, а супрамолекулярные структуры, то есть группы относительно небольших молекул, связанных слабыми химическими связями [9]. Более крупные из них могут быть связаны гидрофобными взаимодействиями, более мелкие — водородными связями и силами Ван-дер-Ваальса [10]. В любом случае, это не какие-то уникальные огромные молекулы, а скопления вполне обычных.

А в 2015 году вышла статья в Nature, авторы которой утверждали, что никаких специфических гумусовых веществ в почве вообще нет [11]. Вместо этого они представляли континуальную модель: почвенное органическое вещество как конвейер переработки и повторного использования органики, от крупных биополимеров до продуктов их деградации, мономеров, и, наконец, углекислого газа (рис. 3). И никакой «гумификации» и «вторичного синтеза»!

Король почвы — голый?

Основа теории гумусообразования рухнула. Нет специфических устойчивых гетерополимеров, которые медленно образуются из простых веществ в почве. Полиароматические соединения — не «ядро» гумусовых веществ, а всего лишь остатки лигнина, флавоноидов и танинов растительного происхождения. Аминокислоты и сахара — разлагающиеся в почве белки, целлюлоза, хитин. Органика в почве не обладает высокой устойчивостью. Она разлагается и поглощается микроорганизмами.

С химией почвы произошло то, что философ науки Томас Кун называл «сменой научной парадигмы». Целый пласт терминов, понятий и теорий химии почв отошел в прошлое.

Совсем исключать возможность полимеризации веществ в почве нельзя. Например, фермент лакказа может вызывать димеризацию фенольных соединений из почвы [12], [13]. Но те огромные гетерополимеры, в виде которых представляли гумус, оказались иллюзией.

Почвоведы все еще продолжают называть гумусом ту фракцию органических веществ, которая выделяется методом щелочной экстракции. Но некоторые ученые призывают вообще отказаться от использования этого слова [11]. С ним связано слишком много допущений, чтобы можно было просто взять и поменять его значение.

Похоже, что термин «гумус» вскоре останется в прошлом, как случилось с терминами «флогистон» и «эфир». Или останется в научном языке анахронизмом, как выпавшие из систематики таксоны «низшие растения» и «простейшие».

Древний — не значит устойчивый

Итак, органические вещества в почве не так уж устойчивы. Но стоп, как же тогда быть с возрастом гумуса? Ведь радиоуглеродный метод не обманешь, а он показывает возраст в сотни и тысячи лет.

Тут надо вспомнить, что именно показывает радиоуглеродный метод. Он основан на соотношении изотопов углерода: радиоактивного ¹⁴С и стабильных ¹²С и ¹³С. В молекулах живого существа это соотношение постоянно — оно зависит от состава углерода в пище (в случае растений — в углекислом газе). Когда организм умирает, ¹⁴С постепенно распадается. Измерив его остаток, мы можем определить «время смерти». Так палеонтологи датируют тела мамонтов в вечной мерзлоте, археологи — останки людей в захоронениях или древесину строений.

Но в почве органические вещества не похоронены раз и навсегда. Они разлагаются, потребляются микроорганизмами и почвенными животными, превращаются в другие вещества — и снова разлагаются. Радиоуглеродный метод определяет не возраст конкретных веществ, а момент изъятия из атмосферы атомов углерода. Атомов, которые могут и не покидать почву, хоть и переходят из одних веществ в другие. Даже углекислый газ, который образуется при дыхании микроорганизмов и корней, перехватывается другими организмами. Его усваивают хемосинтезирующие бактерии (например, нитрификаторы, которые достаточно активны в почве), цианобактерии, мхи, лишайники и водоросли на поверхности почвы. Наконец, его улавливают растения в приземном слое и через корни вновь возвращают в почву. Вещества меняются, но атомы углерода все те же, так что изотопный возраст растет [14].

Иногда углерод в почве правда может становиться устойчивым к разложению. При пожарах органическое вещество превращается в пирогенный углерод, он же уголь. Микроскопические кусочки угля в почве действительно могут иметь изотопный возраст в тысячи лет.

Но и обычные молекулы органических веществ могут становиться устойчивыми, не обладая каким-то уникальным строением. Органика в почве может «прилипать» к твердым минеральным частицам за счет водородных связей и Ван-дер-Ваальсовых сил (рис. 4). В адсорбированном состоянии органика более устойчива к микроорганизмам и их ферментам.

Главными защитниками органических молекул становятся частицы глинистых минералов: каолинита, вермикулита, иллита. Эти частицы очень мелкие, имеют слоистую структуру (рис. 5) и огромную удельную поверхность (десятки и даже сотни квадратных метров на грамм). Вся эта поверхность собирает на себя органические вещества, делая их более устойчивыми. Небольшие молекулы даже проникают в промежутки между слоями минералов и прячутся там от разрушающих ферментов. Крупные органические остатки инкапсулируются, то есть покрываются кусочками глинистых минералов как панцирем, который физически защищает их от микроорганизмов. Чем больше в почве глинистых минералов — тем лучше защищено органическое вещество [15].

Гумус умер, да здравствует гломалин!

Минеральные частицы в почве защищают органику, но и сама органика скрепляет минеральные частицы друг с другом. Хотя гумусовые молекулы остались в прошлом, какие-то органические вещества все же играют роль почвенного «клея».

На эту роль появился новый претендент — гликопротеин (белок, связанный с олигосахаридом) под названием гломалин. Сначала его нашли в мицелии арбускулярной микоризы, специфического симбиоза грибов с корнями растений. Он реагировал с антителами, синтезированными к спорам этих грибов. При помощи этих же антител обнаружили, что гломалин в большом количестве выделяется из почвы. Иммунофлюресцентный анализ показал, что гломалин, как пленка, покрывает поверхность почвенных агрегатов (рис. 6).

Решили, что гломалин попадает из мицелия микоризных грибов в почву, прилипает к частицам почвы и помогает им соединяться в агрегаты. Его считали распространенным во всех почвах, термостабильным, устойчивым к деградации, определяющим качество почвенной структуры и запасы углерода... Что-то напоминает, не правда ли? Похоже, что гломалин пришел на смену гумусовым веществам.

Но скоро и у гломалина начались проблемы. Сначала оказалось, что это не один белок, а как минимум целая группа, которую назвали «родственные гломалину почвенные белки» (glomalin-related soil proteins, GRSP). Содержание GRSP коррелирует с количеством микоризных грибов (значит, они правда синтезируются этими грибами?) и со стабильностью агрегатов почвы (значит, они правда поддерживают почвенную структуру?) [16]. Позже обнаружили, что GRSP — это целый коктейль, который содержит не только белки, но еще липиды и фенольные соединения, и далеко не все из них — продукты арбускулярной микоризы [17]. В какой-то мере гломалин постигла та же судьба, что и гумус. Вместо уникальной молекулы он оказался сложной смесью разных веществ.

В отличие от гумусовых веществ, GRSP точно существуют в почве и точно укрепляют ее структуру. Но, помимо GRSP, почвенные частички скрепляются полисахаридами из клеточных капсул бактерий, адгезией самих бактериальных клеток, выделениями дождевых червей, гифами грибов и корнями растений (рис. 7) [18]. То есть важен не конкретный волшебный компонент, а разнообразие органических веществ и организмов в почве.

Климат, почва, углерод

Органическим веществом почвы занимались химики, агрономы, почвоведы, микробиологи, и в конце концов заинтересовались представители еще одной науки — климатологии.

Углекислый газ в атмосфере — главный источник парникового эффекта. Чтобы замедлить глобальное потепление, люди придумывают способы, как уменьшить его содержание. Можно закачивать углекислый газ в подземные хранилища: сложно, дорого, энергозатратно... Но зачем это делать, если растения сами закачивают углекислый газ в почву и делают это совершенно бесплатно?

Органика в почве — это гигантский резервуар углерода. Его запасы в верхнем метровом слое почвы составляют 1400 гигатонн [19], почти в три раза больше, чем во всей биомассе на Земле. Даже если совсем немного увеличить скорость поступления углерода в почву, это может снизить парниковый эффект.

Размышления на эту тему привели к появлению инициативы 4 per 1000 (четыре промилле). Ее авторы считают, что если мы повысим накопление углерода в почве на 0,4% в год, то этого хватит для того, чтобы ощутимо замедлить глобальное потепление. Для этого нужно:

• бороться с эрозией и деградацией почв;
• снижать вырубку лесов и сажать новые;
• применять органические удобрения в сельском хозяйстве;
• меньше распахивать почву, заменять пашню на пастбища ;
• сеять травы и бобовые растения.

Вспашка на полях разрыхляет почву и уничтожает корни растений — это приводит к потерям углерода. На пастбищах корнеобитаемый слой почвы остается ненарушенным. Кроме того, плотность почвы на пастбищах всегда выше, и это тоже помогает сохранять органические вещества.

В умеренном климате Европы с такими технологиями можно добиться даже не 0,4%, а на порядок большего роста накопления углерода [20]. Но, к сожалению, эти методы работают не всегда. Они могут быть невыгодными для фермеров, неэффективными для некоторых почв или типов климата. Иногда они даже приводят к противоположному результату — увеличивают парниковый эффект.

Например, выращивание бобовых растений, пусть и накапливает в почве углерод, но приводит к выделению более сильного парникового газа [21]. Бобовые при помощи симбиотических бактерий связывают азот (N₂) из воздуха, он поступает в почву, а там денитрифицирующие бактерии превращают его в N₂O, парниковая активность которого в 298 раз выше, чем у углекислого газа. Углерод в почве накопился, но вклад в парниковый эффект с поля бобовых растений стал только больше (рис. 8).

Тем не менее, Межправительственная группа экспертов по изменению климата (МГЭИК) считает почвенный углерод важным способом смягчения глобального потепления. По ее оценкам, правильные методы сельского хозяйства и лесоводства помогут нам связывать до 10,6 гигатонн углекислого газа в год.

Для этого нам нужны новые исследования почвенного углерода, особенно математическое моделирование его динамики. Чем больше мы знаем, тем лучше сможем подобрать подходящие техники землепользования для каждого региона. Так что изучать предстоит еще много. Может быть, даже больше, чем мы уже узнали за двести лет изучения органического вещества почвы.

Литература

1. Вергилий. Георгики. Книга II. Буколики. Георгики. Энеида. М.: «Художественная литература», 1979. — 134 с.;
2. Плиний Старший. Естественная история. Книга семнадцатая. // Катон, Варрон, Колумелла, Плиний. О сельском хозяйстве. М.—Л., 1937. — 266 с.;
3. C. A. CAMPBELL, E. A. PAUL, D. A. RENNIE, K. J. MCCALLUM. (1967). APPLICABILITY OF THE CARBON-DATING METHOD OF ANALYSIS TO SOIL HUMUS STUDIES. Soil Science. 104, 217-224;
4. Dieter Kleinhempel. (1970). Ein Beitrag zur Theorie des Huminstoffzustandes. Archives of Agronomy and Soil Science. 14, 3-14;
5. Stevenson F.J. Humus chemistry: genesis, composition, reactions. John Wiley & Sons, 1995. — 512 p.;
6. M.A. Bolinder, D.A. Angers, M. Giroux, M.R. Laverdière. (1999). Estimating C inputs retained as soil organic matter from corn (Zea Mays L.). Plant and Soil. 215, 85-91;
7. J.A.E. Molina, C.E. Clapp, D.R. Linden, R.R. Allmaras, M.F. Layese, et. al.. (2001). Modeling the incorporation of corn (Zea mays L.) carbon from roots and rhizodeposition into soil organic matter. Soil Biology and Biochemistry. 33, 83-92;
8. Michael Tatzber, Michael Stemmer, Heide Spiegel, Christian Katzlberger, Franz Zehetner, et. al.. (2009). Decomposition of Carbon-14-Labeled Organic Amendments and Humic Acids in a Long-Term Field Experiment. Soil Sci. Soc. Am. J.. 73, 744-750;
9. Alessandro Piccolo. (2001). THE SUPRAMOLECULAR STRUCTURE OF HUMIC SUBSTANCES. Soil Science. 166, 810-832;
10. Antonio Nebbioso, Alessandro Piccolo. (2012). Advances in humeomics: Enhanced structural identification of humic molecules after size fractionation of a soil humic acid. Analytica Chimica Acta. 720, 77-90;
11. Johannes Lehmann, Markus Kleber. (2015). The contentious nature of soil organic matter. Nature. 528, 60-68;
12. A.V. Lisov, L.I. Trubitsina, Z.A. Lisova, I.V. Trubitsin, A.G. Zavarzina, A.A. Leontievsky. (2019). Transformation of humic acids by two-domain laccase from Streptomyces anulatus. Process Biochemistry. 76, 128-135;
13. A. G. Zavarzina. (2010). Heterophase Synthesis of Humic Acids in Soils by Immobilized Phenol Oxidases. Soil Enzymology. 187-205;
14. Gerd Gleixner. (2013). Soil organic matter dynamics: a biological perspective derived from the use of compound-specific isotopes studies. Ecol Res. 28, 683-695;
15. J.A Baldock, J.O Skjemstad. (2000). Role of the soil matrix and minerals in protecting natural organic materials against biological attack. Organic Geochemistry. 31, 697-710;
16. Matthias C. Rillig. (2004). Arbuscular mycorrhizae, glomalin, and soil aggregation. Can. J. Soil. Sci.. 84, 355-363;
17. Jiří Holátko, Martin Brtnický, Jiří Kučerík, Michala Kotianová, Jakub Elbl, et. al.. (2021). Glomalin – Truths, myths, and the future of this elusive soil glycoprotein. Soil Biology and Biochemistry. 153, 108116;
18. А. В. Юдина, Д. С. Фомин, А. Д. Котельникова, Е. Ю. Милановский. (2018). От понятия элементарной почвенной частицы к гранулометрическому и микроагрегатному анализам (обзор). Почвоведение. 1340-1362;
19. N.H. Batjes. (2016). Harmonized soil property values for broad-scale modelling (WISE30sec) with estimates of global soil carbon stocks. Geoderma. 269, 61-68;
20. Paul Poulton, Johnny Johnston, Andy Macdonald, Rodger White, David Powlson. (2018). Major limitations to achieving “4 per 1000” increases in soil organic carbon stock in temperate regions: Evidence from long-term experiments at Rothamsted Research, United Kingdom. Glob Change Biol. 24, 2563-2584;
21. Emanuele Lugato, Adrian Leip, Arwyn Jones. (2018). Mitigation potential of soil carbon management overestimated by neglecting N2O emissions. Nature Clim Change. 8, 219-223.