Конкурс «Био/Мол/Текст»-2020/2021

Эта работа заняла второе место в номинации «Школьная» конкурса «Био/Мол/Текст»-2020/2021.

---

Генеральный партнер конкурса — ежегодная биотехнологическая конференция BiotechClub, организованная международной инновационной биотехнологической компанией BIOCAD.

---

Партнеры номинации — медико-биологическая школа «Вита» и «Новая школа».

---

Спонсор конкурса — компания SkyGen: передовой дистрибьютор продукции для life science на российском рынке.

---

Спонсор конкурса — компания «Диаэм»: крупнейший поставщик оборудования, реагентов и расходных материалов для биологических исследований и производств.

---

«Книжный» спонсор конкурса — «Альпина нон-фикшн»

Кожа молодая и старая

Для начала разберемся, как устроена кожа. Верхний слой — эпидермис — защищает ее от механических повреждений. Под ним расположена дерма, или собственно кожа. В ней залегают протоки желез, нервные окончания, волосяные луковицы, мышечные волокна.

Наконец, «фундаментом» кожи является внеклеточный матрикс (ВКМ). Его основные элементы: гиалуроновая кислота, эластические и коллагеновые волокна — поддерживают структуру кожи, обеспечивая ей здоровый и подтянутый вид. Кроме того, в матриксе содержатся фибробласты — специальные клетки, которые отвечают за его регенерацию — и металлопротеиназы — ферменты, разрушающие вышедшие из строя элементы матрикса. Больше узнать о ВКМ можно в статье «Что такое внеклеточный матрикс и почему его все изучают» [1].

Чем же старая кожа отличается от молодой? Один из самых очевидных признаков — морщины. Они появляются как раз из-за изменений в матриксе: старые коллагеновые волокна начинают разрушаться металлопротеиназами быстрее, чем фибробласты синтезируют новые.

Причина такого сбоя в том, что с возрастом изменяется количество и активность фибробластов. Из-за этого они синтезируют новые волокна коллагена медленнее и в меньших количествах. В то же время увеличивается количество фермента металлопротеиназы, разрушающей уже существующие волокна. В итоге кожа становится морщинистой и дряблой, а ресурсов на восстановление у нее все меньше и меньше. Доказано, что возрастные снижения активности деления и коллагенового синтеза фибробластов связаны с понижением факторов (особых белков-активаторов), связанных с их ростом и развитием, например, с PDGF (связывается с рецепторами фибробластов и повышает их способность к делению) и TGF-beta (участвует в матричном биосинтезе фибробластов).

Поврежденная кожа

Однако на активность фибробластов, целостность коллагеновых нитей и количество металопротеиназы влияет не только возраст. Кожа может сильно повреждаться в результате механического воздействия и внешних факторов, таких как грязный воздух, курение, несбалансированное питание или УФ-излучение. Для последнего даже введен термин «фотостарение», означающий ухудшение состояния кожи в результате избытка попадающего на нее ультрафиолета [2], [3]. Признаками фотостарения является гиперпигментация, сухость, грубость и тусклый цвет кожи. Более того, результатом фотостарения может стать рак кожи.

Реакцией кожи на повреждение является запуск процесса заживления. Стенки сосудов на поврежденном участке становятся липкими; к ним приклеиваются тромбоциты и лейкоциты, образуя «пробку». В то же время запускается каскад химических реакций, превращающий один из растворимых белков крови — фибриноген — в нерастворимый фибрин. С помощью этого белка «пробка» из тромбоцитов дополнительно уплотняется, и на месте раны образуется характерная темная корочка, если рана открытая, или темное пятно и уплотнение, если повреждены только внутренние слои кожи (например, при легких ожогах страдает в первую очередь дерма, при этом кожный покров остается целым). Далее подключаются фибробласты: они мигрируют к поврежденному участку кожи, активно делятся и начинают продуцировать коллаген. В результате среда внутри тканей становится более благоприятной; на поврежденном участке запускаются процессы реэпителизации (восстановления кожи) [4].

Однако полная регенерация практически невозможна, и в результате на месте повреждения остается шрам.

Относительно недавно перед учеными открылся новый способ омоложения кожи и улучшения ее качества. Он основан на терапевтических свойствах экзосом, секретируемых стволовыми клетками: мезенхимальными стромальными клетками в случае механических повреждений кожи и человеческими индуцированными плюрипотентными клетками — в случае проведения клеточного омоложения. Стоит признаться, что на данном этапе этот способ является далеко не самым эффективным и требует множества дополнительных исследований, однако его потенциал неоспорим.

Экзосомы: что это такое?

Экзосомы — «бутылочная почта» организма. Это мелкие мембранные пузырьки, которые выделяются в межклеточное пространство клетками самых разных тканей и органов и с кровью разносятся по организму. Внутри пузырьков находится «коктейль» из белков, ДНК, разных видов РНК и липидов [5]. Компоненты этого коктейля могут участвовать в межклеточной коммуникации, иммунном ответе и многих других процессах. В статьях «Биомолекулы» «Нобелевская премия по физиологии и медицине (2013): везикулярный транспорт» и «Экзосома — механизм координации и взаимопомощи клеток организма» вы можете узнать больше об экзосомах и их роли в межклеточной коммуникации [6], [7].

Из всего коктейля наибольший интерес представляют микроРНК, так как, видимо, именно ими обусловлен терапевтический эффект экзосом.

Как уже было сказано, экзосомы, использующиеся для терапии кожи, выделяются из мезенхимальных стромальных клеток и человеческих индуцированных плюрипотентных клеток. Рассмотрим свойства обоих типов клеток и их экзосом.

Мезенхимальные стромальные клетки и их экзосомы в лечении кожи

Мезенхимальные стромальные клетки (МСК) — это стволовые клетки, которые находятся в соединительной ткани. Из них получаются остеобласты, хондроциты и адипоциты.

Кроме того, эти клетки обладают мощным потенциалом для восстановления кожи. Доказано, что MСК оказывают положительный эффект на раны и шрамы: после терапии следы от повреждений почти пропадают, а раны заживают в разы быстрее [8].

В силу своей способности к неограниченному делению (как и другие стволовые клетки), мезенхимальные клетки стали привлекательным вариантом для использования в регенеративной медицине. На сегодня эти клетки — важный компонент клеточной терапии, направленной на ускорение и оптимизацию лечения повреждений кожи. Стоит отметить, что в ранних исследованиях изучали мезенхимальные стромальные клетки костного мозга (МСКкм). Однако костный мозг — ограниченный ресурс, да и процедура по получению из него клеток очень болезненна. Поэтому в последнее время идет активный поиск альтернативных «депо» для извлечения МСК. Таковыми являются жировая ткань, эпидермальная ткань, амниотическая жидкость (рис. 1) [9]. Интересно, что биологический эффект МСК зависит не от места, откуда вы их взяли, а от микросреды, в которую поместили. Например, когда МСК попадают на место свежего повреждения, они работают на ускорение реэпителизации, а в месте, где реэпителизация уже прошла, — подавляют процесс образования шрама [8].

Более продвинутой является терапия не самими МСК, а их экзосомами. Эффект от лечения такой же, как и при клеточной терапии; при этом у экзосом есть ряд преимуществ: они легко выделяются из клетки, не требуют особых условий хранения и транспортировки и могут быть применены в удобное для пациента время. При этом они обладают большой терапевтической эффективностью без риска образования опухолей или отторжения в результате иммунного ответа организма [10].

Недавние исследования открывают нам еще одно преимущество экзосом перед МСК: оказывается, экзосомы могут менять свой «коктейль» в зависимости от микросреды клетки, которая их продуцирует (рис. 2) [11]. В будущем это позволит ученым «подстраивать» экзосомы под конкретные задачи, например, для регенерации фибробластов или для высокоэффективного заживления раны.

Молекулярный механизм, обуславливающий терапевтический эффект мезенхимальных экзосом, требует более детального изучения, так как на данный момент большинство экспериментов проводились на животных.

Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки

Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (иПСК) были открыты в 2006 году японским ученым Синъя Яманака. В 2012 году совместно с Джоном Гердоном он получил за эту разработку Нобелевскую премию.

Наша жизнь начинается, когда оплодотворенная яйцеклетка делится и образует дочерние клетки, которые, в свою очередь, продолжат делиться. Вначале все клетки полностью идентичны, но в процессе развития они превращаются в клетки различных тканей. Яманака предположил, что есть какие-то специальные гены, отвечающие за то, будет ли клетка стволовой или дифференцируется в специализированную клетку. В ходе экспериментов на мышах ученый действительно обнаружил четыре гена — Oct3/4, Sox2, Klf4 и cMyc — которые отвечают за индуцирование плюрипотентности в мышиных зародышевых и взрослых фибробластах. В активированном состоянии эти гены способны перепрограммировать клетки кожи мыши обратно в стволовые клетки, которые, в свою очередь, могут превратиться в любой тип клеток тела [12].

Плюрипотентные стволовые клетки неограниченно делятся и дифференцируются в клетки всех трех зародышевых листков. Эти две особенности делают ПСК привлекательным ресурсом для клеточной терапии различных болезней и травм. Человеческие индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (чиПСК) были получены в 2007. С тех пор множество лабораторий провели клинические эксперименты на добровольцах, а некоторые из них даже внедрили методы клеточной терапии с использованием чиПСК в свою практику.

В дерматологии этот метод был применен недавно, однако уже сегодня есть результаты исследований, указывающие на то, что чиПСК, а точнее — их экзосомы — замедляют старение кожи и возобновляют процессы ее регенерации. Однако при работе с иПСК возникает ряд сложностей: например, они все же слегка отличаются от эмбриональных стволовых клеток, а также довольно часто оказываются онкогенными [12]. Подробнее об этом читайте в статье «Снежный ком проблем с плюрипотентностью» [13]. Экзосомы иПСК более «дружелюбны» по отношению к нашему организму и имеют меньше побочных эффектов, не уступая в количестве положительных.

Что могут экзосомы плюрипотентных стволовых клеток

Во-первых, экзосомы иПСК ускоряют пролиферацию фибробластов (рис. 3). Интересно, что «передозировка» экзосомами практически невозможна: если доза слишком велика, то «лишние» экзосомы просто не проявляют никакой активности [14].

Кроме пролиферации, экзосомы иПСК повышают клеточную миграцию фибробластов, из-за чего восстановление кожи после механического повреждения идет быстрее. Для исследования эффекта иПСК-экзосом на миграцию фибробластов ученые наблюдали за изменением количества фибробластов на свежеповрежденном участке кожи. В результате стало ясно, что количественные показатели фибробластов, обработанных иПСК-экзосомами, куда выше, чем у контрольной группы (рис. 4).

В начале статьи упоминалось пагубное влияние УФ-излучения на кожу: от его воздействия разрушаются нити коллагена, повреждаются фибробласты и увеличивается количество металлопротеиназ. Оказывается, иПСК-экзосомы могут помочь и здесь: они восстанавливают поврежденные фибробласты и повышают их жизнеспособность более чем на 20% (рис. 5)! Таким образом, через уменьшение негативного влияния ультрафиолета на фибробласты кожи, иПСК-экзосомы косвенно влияют на процессы регенерации и пролиферации кожи в целом [14].

Недостатки методов клеточной терапии кожи с участием стволовых клеток

Какими бы многообещающими ни были эксперименты со стволовыми клетками, их использование для терапии в последнее время теряет популярность. Основными причинами являются иммунный ответ организма в ответ на введение стволовых клеток донора и их последующее отторжение и онкогенность стволовых клеток в целом, а особенно иПСК. Это обусловлено репрограммирующими факторами (Oct3/4, Sox2, Klf4, и cMyc), которые связаны с онкогенезом, и генетическими мутациями, которые случаются при быстром делении стволовых клеток [12].

Поэтому ученые постепенно переходят от использования стволовых клеток в клеточной терапии к использованию исключительно самих экзосом, синтезируемых этими клетками. У экзосом куда меньшая онкогенность, они не вызывают иммунного ответа, а их регенеративный потенциал едва ли не выше, чем у стволовых клеток.

Экзосомная терапия: основные выводы и перспективы

На основе приведенных в обзоре экспериментов можно сделать вывод, что трансплантация МСК и иПСК в место повреждения кожи способна значительно снизить время регенерации пораженного участка, а также улучшить состояние рубцов и шрамов. Кроме того, экзосомы стволовых клеток, в частности иПСК-экзосомы, способны предотвращать внешнее старение кожи, вызванное УФ-излучением. При этом стоит учитывать ограничения в использовании стволовых клеток в силу их потенциальной онкогенности и вероятности отторжения донорских клеток в результате иммунного ответа. Решением данной проблемы может стать более безопасная экзосомная терапия.

Очевидно, что тема применения стволовых клеток различного происхождения и экзосом, секретируемых ими, довольно недавно открылась ученым и требует дополнительных исследований и клинических экспериментов, в том числе экспериментов на людях, чтобы точно выяснить механизмы работы экзосом и их поведение в тканях человека, а также изучить возможные подводные камни такого подхода и способы их преодоления. Однако уже на сегодняшний день можно утверждать, что экзосомная терапия — новый шаг как в лечении дерматитов различного происхождения, так и в сфере эстетической медицины в качестве омолаживающих процедур.

Литература

1. Что такое внеклеточный матрикс и почему его все изучают;
2. Barbara A. Gilchrest. (1989). Skin aging and photoaging: An overview. Journal of the American Academy of Dermatology. 21, 610-613;
3. Helfrich Y.R., Sachs D. L., Voorhees J. J. (2008). Overview of skin aging and photoaging. The Journal of Dermatology Nurses’ Association. 3, 177–183;
4. J.M. Reinke, H. Sorg. (2012). Wound Repair and Regeneration. Eur Surg Res. 49, 35-43;
5. Anders Waldenström, Nina Gennebäck, Urban Hellman, Gunnar Ronquist. (2012). Cardiomyocyte Microvesicles Contain DNA/RNA and Convey Biological Messages to Target Cells. PLoS ONE. 7, e34653;
6. Нобелевская премия по физиологии и медицине (2013): везикулярный транспорт;
7. Экзосома — механизм координации и взаимопомощи клеток организма;
8. Kang Lu, Hai-yin Li, Kuang Yang, Jun-long Wu, Xiao-wei Cai, et. al.. (2017). Exosomes as potential alternatives to stem cell therapy for intervertebral disc degeneration: in-vitro study on exosomes in interaction of nucleus pulposus cells and bone marrow mesenchymal stem cells. Stem Cell Res Ther. 8;
9. Mingchen Xiong, Qi Zhang, Weijie Hu, Chongru Zhao, Wenchang Lv, et. al.. (2020). Exosomes From Adipose-Derived Stem Cells: The Emerging Roles and Applications in Tissue Regeneration of Plastic and Cosmetic Surgery. Front. Cell Dev. Biol.. 8;
10. Dongdong Ti, Haojie Hao, Chuan Tong, Jiejie Liu, Liang Dong, et. al.. (2015). LPS-preconditioned mesenchymal stromal cells modify macrophage polarization for resolution of chronic inflammation via exosome-shuttled let-7b. J Transl Med. 13;
11. Peng Hu, Qinxin Yang, Qi Wang, Chenshuo Shi, Dali Wang, et. al.. (2019). Mesenchymal stromal cells-exosomes: a promising cell-free therapeutic tool for wound healing and cutaneous regeneration. Burns & Trauma. 7;
12. Shinya Yamanaka. (2020). Pluripotent Stem Cell-Based Cell Therapy—Promise and Challenges. Cell Stem Cell. 27, 523-531;
13. Снежный ком проблем с плюрипотентностью;
14. Myeongsik Oh, Jinhee Lee, Yu Kim, Won Rhee, Ju Park. (2018). Exosomes Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells Ameliorate the Aging of Skin Fibroblasts. IJMS. 19, 1715.