Конкурс «био/мол/текст»-2018

Эта работа опубликована в номинации «Свободная тема» конкурса «био/мол/текст»-2018.

---

Генеральный спонсор конкурса — компания «Диаэм»: крупнейший поставщик оборудования, реагентов и расходных материалов для биологических исследований и производств.

---

Спонсором приза зрительских симпатий выступил медико-генетический центр Genotek.

---

«Книжный» спонсор конкурса — «Альпина нон-фикшн»

Воздух дает нам жизнь, он же приносит и болезни.
Аристотель

В 2008 году в ежемесячном издании «Бюллетень ВОЗ» и на сайте организации было опубликовано интервью с Бриджитт Жикель, профессором из Института Пастера в Париже. Она рассказала о лабораториях по всему миру, занятых передовыми разработками в сфере фтизиатрии, и о неприятных особенностях туберкулеза. Так, с палочкой Коха (Mycobacterium tuberculosis или просто Mtb), вызывающей эту болезнь, очень трудно работать, так как она относится к медленнорастущим микобактериям. Из-за этого на проведение экспериментов нужны немалые деньги и время, а результаты исследований появляются такими малыми порциями, что продвижение к конечной цели — идеальному лекарству от туберкулеза — идет очень медленно. Профессор приводит читателя к выводу, что в борьбе с туберкулезом много сложностей, и лишь совместными усилиями ученых из всех стран он может быть побежден [3]. Излечение человечества от «архаичной» инфекции затянулось до сих пор, и фтизиатрия сегодня является одним из передовых (и вместе с тем одним из наиболее изученных) направлений в биомедицине.

Но наука развивается. С 2008 года прошло уже десять лет, и человечество стало прогрессивнее и в техническом плане, и в плане владения необходимой информацией. Сегодня мы входим в такой период, когда рамки невозможного стираются, и излечение человечества от инфекций, которые привели к миллионам смертей, просто неизбежно. Так что же делают ученые для этого? Помогут ли новые технологии человечеству в победе над палочкой Коха? И главное — как скоро мы сможем заявить, что туберкулез действительно побежден? В этом мы и попытаемся разобраться... Но начнем с начала.

Несколько слов о туберкулезе

Палочка Коха, вызывающая туберкулез, относится к роду Mycobacterium. Сегодня науке известно более 74 видов микобактерий, широко распространенных в почве, воде, воздухе, среди людей и животных. Приставка «мико» в названии микобактерий переводится с латыни как «воск». Она была дана этим бактериям неспроста: в их клеточной стенке (рис. 1) содержатся длинные воскообразные молекулы — миколовые кислоты. Вместе с огромными полисахаридами арабиногалактанами, которые также есть только у микобактерий, они составляют прочную оболочку, защищающую бактерию от кислот, щелочей, спирта и других веществ.

Если инфекция становится активной, то в 90% случаев она поражает легкие, хотя может развиться также и в любой другой части тела. Общие признаки туберкулеза включают в себя лихорадку, озноб, потерю аппетита и усталость. Легочный туберкулез проявляется также болью в груди и длительным кашлем с мокротой или даже с кровью [4].

Бактерии попадают в организм воздушно-капельным путем. Сначала они окажутся в легких, где будут медленно делиться, и, пока их немного, останутся почти незаметными для иммунитета. Mtb не выделяют токсинов, поэтому при инфицировании яркие симптомы сразу не возникают. В течение инкубационного периода, который длится от 4 до 12 недель, палочка Коха привлекает внимание исключительно клеток врожденного иммунитета — фагоцитов. Первыми на место являются нейтрофилы, но их возможности уничтожать микобактерий ограниченны, и тогда за дело берутся макрофаги — самые древние иммунные клетки.

Фагоцитоз происходит так: сначала клетки фиксируют микобактерий на мембране, затем этот участок мембраны погружается в цитоплазму фагоцита и образует фагосому — пузырек с бактерией. Затем фагосома сливается с лизосомами, наполненными ферментами, переваривающими бактерии. Если вирулентность возбудителя невысока, его существование в организме на этом заканчивается. Однако микобактерии со значительной вирулентностью синтезируют много так называемого липоарабиноманнана (также известного как корд-фактор) — вещества, мешающего лизосомам сливаться с фагосомами, и бактерии беспрепятственно размножаются внутри макрофага. В результате зараженный макрофаг погибает, а микобактерии оказываются на воле. Когда макрофаги погибают, из них вытекают ферменты, повреждающие ближайшие клетки. В этом случае начинается патология: в легких наблюдают очаги распадающейся ткани, гной, воспаление и каверны. Но возможен и третий вариант. Если иммунитет и вирулентность сбалансированы, то бактерии остаются в макрофагах, и организм изолирует очаг инфекции, образуя гранулемы — окруженные плотной капсулой упорядоченные скопления макрофагов, Т-лимфоцитов и соединительной ткани [5]. Но внутри зарубцевавшейся гранулемы в течение всей жизни по-прежнему живут микобактерии. Удалить попавшие однажды в организм палочки почти невозможно, а это таит в себе риск активации туберкулеза на любом этапе жизни при ухудшении ее условий, старении или заражении ВИЧ. О распространенности этого вида поражения свидетельствует тот факт, что зажившие гранулемы встречаются у 97% всех умерших взрослых людей (рис. 2) [6]. Этим, отчасти, объясняется несостоятельность ликвидации туберкулеза в ближайшее время.

Первые шаги

Туберкулез — одна из древнейших болезней. Его обнаружили даже у египетской мумии, найденной археологами сто пятьдесят лет назад [7]!

В Древней Греции уже знали о существовании этой болезни и назвали ее словом phtisis (истощение), подчеркивая резкое ослабление организма больного. От этого слова впоследствии произошло название науки о туберкулезе — фтизиатрии. Об этой болезни писали также древнегреческие мыслители Геродот, Исократ и Аристотель, а описание ее симптомов находили на Ближнем Востоке, в Индии, Египте, Междуречье и многих других странах.

Из-за сходства симптомов чахотки с признаками лихорадок и катаров (бронхитов) диагностика заболевания вплоть до начала XX века часто запаздывала на несколько месяцев. Со временем, чахоткой стали называть только первый ее вид по Гиппократу. Большинство пациентов переходило в категорию чахоточных, когда вылечить их было уже невозможно, либо когда врачи не могли понять, чем они болеют.

К началу XIX века подходы к лечению мало изменились со времен Гиппократа. Для лечения туберкулеза применяли всевозможные средства, однако, большинство из них были малоэффективны, поскольку болезнь очень хитроумна — она плохо поддается даже современному лечению. В качестве противокашлевой процедуры использовали кровопускание, а мокроту разжижали специальными пилюлями из смеси кардамона, морского лука и аммониака (эта смола и сейчас входит в состав отхаркивающих средств). Когда болезнь уже запущена, врачи решались и на более серьезные меры. Так как в кровохаркании винили нарыв легких, врачи старались его прорвать и очистить, накладывая на спину нарывный пластырь или создавая между ребрами искусственную язву с нагноением. Оговаривалось, что средства, причиняющие наименьшую боль, наименее полезны.

Врачи считали, что одними лекарствами и процедурами хворь из организма не выгонишь. Их следовало сочетать с прогулками, размеренным образом жизни и диетой, исключающей спиртное и еду с выраженным вкусом и запахом. Видели пользу в воздухе с «испражнениями животных», которые, якобы, выгоняют хворь из организма, а также в посещении санаториев.

Так как чахотка считалась незаразной, ни о какой технике безопасности при уходе за больными речи тогда не шло. Грязное белье больных отдавали в прачечную, палаты подметали, вздымая в воздух пыль с бактериями, а в моменты облегчения чахоточные выходили в свет.

Основными причинами заболевания считались всяческие излишества, «неумеренность» — как физическая (обжорство, алкоголизм, малоподвижный образ жизни, излишнее перенапряжение), так и эмоциональная (сильные страсти, беспокойство и др.) Считалось даже, что чахотка в основном одолевает утонченные, романтические и творческие натуры, склонные к высоким и сильным чувствам, меланхолии, философии, неприятию низменного, способные глубоко переживать реальные и воображаемые события, — и потому, как ни смешно покажется в наши дни, — многие не хотели вовсе избавляться от нее. Чахотку называли также болезнью аристократов.

Женщина с начальной стадией туберкулеза легких — это практически идеал красоты XIX века: худая, с бледной кожей, румянцем, блестящими выразительными глазами и, само собой, глубокими думами. Чтобы добиться такого же эффекта многие здоровые женщины капали в глаза белладонну и натирали кожу разными средствами, в том числе с мышьяком, и даже пили уксус. От чахотки мечтал умереть Байрон, и умерли Шопен и Чехов.

Позже выяснилось, что большинство жертв чахотки — не аристократы, а фабричные рабочие и заключенные. Тогда от нее в России умирал каждый десятый. В эту эпоху главными причинами чахотки считали спертый воздух и пыль всякого рода [9].

Все изменилось после 24 марта 1882 года, когда Роберт Кох (рис. 4) объявил об открытии туберкулезной палочки, или бациллы (bacillus — «палочка» по латыни; не путать с названием класса и рода совсем других бактерий! — Ред.) [40], и это открытие было принято врачами. Впервые же гипотезу о том, что чахотку вызывают мельчайшие существа, за 160 лет до Коха выдвинул англичанин Бенджамин Мартин, но тогда ученые эту мысль не поддержали. Открытие Коха стимулировало поиск препаратов, действующих конкретно на палочку Коха. Теперь 24 марта, в день открытия палочки Коха, ежегодно отмечается всемирный день борьбы с туберкулезом, учрежденный ВОЗ.

Диагностика туберкулеза

Вскоре ученые предприняли первые шаги для изобретения средства диагностики заболевания. В 1890 году Кох сообщил об открытии им туберкулина, который представляет собой глицериновый экстракт из туберкулезных бацилл M. tuberculosis и M. bovis (первая из них вызывает туберкулез у людей, а вторая — у животных). И тогда ученые предположили, что при помощи этой жидкости, на которую будет реагировать иммунитет, можно проверить человека на то, болен ли он.

В 1907 году австрийский педиатр Клеменс Пирке заинтересовался этой идеей и предложил наносить туберкулин на кожу, специально поцарапанную скарификатором (это пластинка с острыми зубчиками, которой очень часто пользуются при заборе крови из пальца). Через год француз Шарль Манту предложил вводить туберкулин не на, а под кожу и по прошествии трех дней измерять размер «пуговки». Как оказалось, если вводить туберкулин подкожно, то тест более чувствителен [10]. Впоследствии Шарль Манту разработал тест на основе туберкулина, которым можно проверять домашних животных на наличие инфекции.

Эти гипотезы не остались незамеченными. Немецкий врач Феликс Мендель в 1908 году их учел и разработал тест с использованием туберкулина, который он назвал в честь Манту. Так была введена в практику туберкулиновая проба. Кстати, в англоязычных странах ее в знак признательности Менделю сегодня называют пробой Менделя—Манту.

Поначалу тест был совершенно ненадежен из-за ненужных примесей в туберкулине — продуктов жизнедеятельности бактерий и части питательной среды, которые вызывали ложные результаты. Такой туберкулин получил маркировку ATK (Alt Tuberculin Koch, с немецкого — «старый туберкулин Коха»). Американский биохимик Флоренс Зайберт решила прекратить это безобразие и несколько лет занималась разработкой метода очистки белков из микобактерии, в результате чего получила белок PPD (purified protein derivative, с английского — «производственно очищенный белок»), на основе которого удалось создать более надежный тест. Первая публикация Зайберт появилась в 1934 году, а в 1940-м этот белок стал международным стандартом [11].

В 1897 году врач из Бостона Фрэнсис Уильямс обнаружил, что инфекция в легких заметна в рентгеновских лучах, а в 1904 году российский ученый Алексей Абрикосов подробно описал картину состояния больных легких на рентгенограмме (рис. 5). В частности, на снимке, в зависимости от запущенности туберкулеза, можно увидеть затемнения, каверны (полости, оставшиеся после распада ткани легкого, где сидит больше всего бактерий) и фиброзные участки. Так был заложен еще один классический метод диагностики туберкулеза — рентгенография.

Вскоре появился метод, очень похожий на предыдущий — флюорография. Первоначально флюороскоп пытались использовать для самых разных целей — начиная от поиска оружия у людей (это тот самый аппарат, который просвечивает багаж в аэропортах) и заканчивая обувным делом. По сути, это тот же самый рентген, только изображение получается не вследствие химических процессов на пленке, происходящих при попадании рентгеновских лучей, а проецируется на специальный флюоресцентный экран, где энергия рентгеновского излучения преобразуется в видимый свет (общий принцип действия лучевых методов диагностики изображен на рисунке 6). С экрана же изображение переносится на небольшую фотопленку или камеру. Для диагностики туберкулеза первым начал использовать флюорографию бразильский пульмонолог Мануэль Диаз де Абреу в 1918 году [12].

Сегодня рентген и флюорография являются основным оружием в борьбе против туберкулеза, хотя у них есть немало противников, поскольку они, опять же, имеют свои минусы. Во-первых, для некоторых пациентов, таких как беременные женщины, больные в тяжелом состоянии и люди с открытым кровотечением, существуют противопоказания. Во-вторых, здоровым людям флюорографию можно делать только раз в год (в связи с тем, что рентгеновское излучение способно вызывать мутации). Поэтому велик шанс, что туберкулез будет диагностирован слишком поздно. И поэтому ученые все равно ищут альтернативный вариант диагностики туберкулеза на ранней стадии.

Еще один неплохой вариант диагностики — бактериологический анализ мокроты — нашли в середине прошлого века с развитием микроскопии. Суть этого метода заключается в рассмотрении специально окрашенного мазка и поиска в нем палочек Коха. Если их там не нашли, то анализ проводят несколько раз, чтобы проверить результат [16].

Чаще всего мазок окрашивают по Цилю—Нильсену. В этом случае выявляют так называемые КУМ — кислотоустойчивые микобактерии (как понятно из названия, они не погибают в кислотах, в отличие от прочих бактерий), к которым относится палочка Коха. Бактерии окрашивают разными красителями (сначала карболовым фуксином Циля, потом метиленовым синим), причем между окрашиваниями их обрабатывают кислотой. Все выжившие бактерии окрашиваются в красный цвет, а прочие — в голубой. Палочки Коха в препарате выглядят как тонкие палочки малинового цвета, имеющие длину 1–10 мкм, а ширину — до 0,6 мкм (рис. 8).

Если лаборант нашел в мокроте микобактерии в достаточном количестве, то следующим этапом диагностики становится посев образца в питательную среду — берут отдельную колонию в образце, поддевают ее специальным инструментом и перемещают на чашку Петри с питательной средой. Будучи помещенными в оптимальные условия, микроорганизмы быстрее растут, что позволяет уточнить их вид и оценить чувствительность к разным антибиотикам.

В качестве стандарта для выделения возбудителя болезни рекомендуется среда Левенштейна—Йенсена. Это плотная яичная среда, на которой рост микобактерий получают на 20–25-й день после посева [17]. В нашей стране широкое распространение получила также яичная среда Финн-II. Она отличается тем, что вместо аминокислоты L-аспарагина в ней используют глутамат натрия, запускающий иные пути синтеза аминокислот микобактерий. Рост появляется на этой среде раньше, а частота выделения бактерий на 6–8% выше.

Бактериоскопический метод является крайне чувствительным. При однократном обследовании чувствительность составляет около 85%, а если пробы исследуют три раза, то анализ покажет чувствительность 98%. Но не стоит забывать об этих 2%...

Если бактериоскопия не показала наличие у человека палочек Коха, но врачи считают, что «этого быть не может», то тогда производят флотацию. В биомедицину этот термин перекочевал из горнодобывающей промышленности, где он обозначает один из методов обогащения полезных ископаемых, при котором их обрабатывают жидкостями с разной плотностью, в результате чего нужный материал оказывается на границе их раздела. В биомедицине дело обстоит так же, только вместо полезных ископаемых — образец мокроты, откуда выделяются бактерии. В результате бактерий становится больше на единицу объема, и их становится проще визуализировать. Метод этот также получил название «метод Поттенджера» [18].

В 1930-х для выявления кислотоустойчивых микобактерий (КУМ) впервые использовали метод флуоресцентной микроскопии — еще один метод диагностики по мазку. Как известно, все молекулы способны поглощать кванты света и переходить в электронно-возбужденные состояния. Возвращение молекулы в «обычное» состояние, сопровождающееся излучением света, называют флуоресценцией. Различные молекулы, флуоресцируют в разной степени — многие из них излучают так мало света, что этого даже не видно. Метод оказался очень ценным для биологии благодаря применению ярких флуоресцентных красителей оранжевого цвета, которые добавляются перед процедурой в мазок и там прикрепляются к воскообразным структурам в клеточной стенке, которые характерны только для микобактерий. Затем этот мазок изучают через специальный микроскоп, устройство которого показано на рисунке 9. Он подсвечивает образец возбуждающим источником света, из-за чего краситель начинает светиться, и бактерии становятся видны (рис. 10). Большой контраст способствует более комфортному распознаванию бактерий по сравнению с методом окраски по Цилю—Нильсену, в связи с чем можно исследовать образцы с меньшим увеличением и, благодаря этому, намного быстрее. Метод этот очень понравился многим оснащенным лабораториям, но он не стал популярен по нескольким причинам. Во-первых, следует помнить о поговорке, придуманной учеными: «Не все то КУМ, что блестит». А во-вторых, недостатком являются большие расходы, связанные с обслуживанием специального микроскопа. Поэтому ученые решили не переходить к новому методу диагностики [19].

В 2008 году ввели в массовое употребление еще одну пробу, напоминающую Манту и, по заверениям изобретателей, способную ее заменить — диаскинтест. Это аллерген, комбинация двух белков, которые есть у палочки Коха, и нет у бактерии, используемой в прививках от туберкулеза — Mycobacterium bovis. Поэтому после перенесенной вакцины диаскинтест, в отличие от пробы Манту, не показывает ложноположительные результаты. Это различие определяет высокую чувствительность препарата в сравнении с туберкулином [20].

Лечение туберкулеза

Люди понимали, что нарывные пластыри и кровопускания — не самые действенные методы лечения туберкулеза. С начала XX века для увеличения эффективности лечения начали применять ингаляции разными импровизированными препаратами (по сути, давали больным все подряд, в надежде на то, что хоть что-то из этого поможет, но тщетно) и введение их непосредственно в легкое. Но самым лучшим решением тогда была операция. Именно благодаря попыткам укротить туберкулез скальпелем торакальная хирургия (то есть хирургия органов грудной клетки) достигла своего расцвета, и сейчас мы можем гордиться всем тем, что мы умеем и имеем в данной области, в том числе и для оперативного лечения других болезней.

Важным оружием в борьбе с туберкулезом является вакцинация. В 1908 году французы Альбер Кальметт и Камиль Герен работали над получением культур туберкулезной палочки и исследованием разных питательных сред. Как оказалось, на среде на основе глицерина, желчи и картофеля вырастают палочки наименьшей вирулентности. И тогда коллеги решили выяснить, нельзя ли посредством повторяющегося культивирования вырастить ослабленный штамм для вакцинации. Через два года они создали на основе своих научных изысканий бациллу Кальметта—Герена (БЦЖ), применяемую на людях по сей день [22].

Следующей важнейшей вехой в истории борьбы с туберкулезом стало лето 1943 года. В то время на птичьих дворах среди кур распространилась какая-то странная болезнь, источник которой, как предполагалось, находился в почве. Студенты под руководством профессора почвенной микробиологии Зельмана Ваксмана [42] изымали больных кур с птичьих дворов для выявления причины заболевания. Тогда один из студентов, Альберт Шатц, нашел в горле нескольких птиц комочки почвы, обросшие плесневыми грибками, и обнаружил в них стрептомицин. Он стал его основательно изучать и, протестировав воздействие стрептомицина на различные бактерии, Шатц узнал, что это вещество убивает палочки Коха, против которых недавно открытый пенициллин был бессилен. Во время клинических испытаний состояние пациентов, дни которых были сочтены, улучшилось, и они пошли на поправку. В 1952 году Ваксман получил за открытие своего студента Нобелевскую премию по физиологии или медицине, а Шатц стал обладателем «правового и научного статуса сооткрывателя стрептомицина». Кстати, термин «антибиотик» впервые предложил сам Ваксман [23].

Первые несколько лет стрептомицин обладал крайне высокой активностью: можно было даже налить воду во флакон, где до этого был препарат, и выпить ее — это все равно давало эффект. Но всего лишь через 10 лет эффективность снизилась, а сейчас действие и вовсе ничтожно.

Совершенно новый подход к контролю туберкулеза был создан благодаря стараниям голландского доктора Карела Стибло, который в 1974 году предложил принципы стратегии DOTS — диагностики бактериоскопическим методом, терапии специальными препаратами, регулярных поставок этих препаратов и системы отчетности, которая позволяет оценивать результаты лечения каждого больного. В 1994 году эту стратегию рекомендовала ВОЗ для применения в странах, для которых проблема туберкулеза актуальна. DOTS до сих пор является основополагающей схемой лечения, хотя современные медики отчасти модифицировали ее.

Но туберкулез и не думал сдаваться. В 80-е появились лекарственно-устойчивые штаммы туберкулеза — грозные супербактерии, не реагирующие ни на рифампицин, ни на другие антибиотики. В 2006 году появилась бактерия, которая не реагирует почти ни на какие лекарства — возбудитель туберкулеза с широкой лекарственной устойчивостью (ШЛУ-ТБ). Бушует эта бактерия сейчас в Прибалтике, России, Украине и Китае. Сегодня в разных регионах России к антибиотикам устойчивы от 10 до 40% штаммов Mtb. Лекарственная устойчивость у бактерий появилась, в основном, из-за легкомысленного обращения несознательных граждан с антибиотиками, которые, занимаясь бесконтрольным самолечением, принимают их слишком часто, без особой необходимости и без назначения врача, не соблюдая правильные схемы лечения, что влечет за собой приспосабливаемость бактерий к лекарствам и, грубо говоря, теперь в отношении бактерий можно применить известное выражение «То, что нас не убивает — делает сильнее» .

Подробнее о развитии устойчивости к антибиотикам рассказывает спецпроект «Биомолекулы» «Антибиотики и антибиотикорезистентность». — Ред.

В 1993 году ВОЗ провозгласила ситуацию с туберкулезом «глобальной чрезвычайной ситуацией в области здравоохранения», а в 2006 году организация разработала глобальный план «Остановить туберкулез», который направлен на искоренение заболевания до 2015 года. Цели организации так и не были достигнуты за счет роста ВИЧ-ассоциированного туберкулеза и появления лекарственно-устойчивых его форм [25]. И тогда ВОЗ поставила перед собой новый план — победить туберкулез к 2030 году. Надеемся, эта проблема, наконец, будет решена.

Самая современная на сегодняшний день тактика лечения впервые выявленного туберкулеза легких такова. Сначала пациент пьет одновременно шесть месяцев так называемые препараты первой линии — терапия при туберкулезе всегда комбинированная.

1. Рифампицин. Его механизм действия связан с подавлением фермента ДНК-зависимой РНК-полимеразы, в результате чего клетка перестает синтезировать РНК и погибает. Рифампицин хорошо проникает в ткани и жидкости организма и обнаруживается в терапевтических концентрациях в мокроте и содержимом каверн. Однако рифампицин нельзя пить людям с ВИЧ-положительным статусом.
2. Изониазид. Механизм действия его связан с угнетением синтеза миколовых кислот в клеточной стенке бактерий. Также препарат применяют и в ветеринарии для лечения кожного туберкулеза у собак и кошек, но у них нередко возникают тяжелейшие побочные эффекты. У человека же при его применении может возникнуть гепатит. Несмотря на это, изониазид, благодаря своей феноменальной активности, остается одним из самых крепких оплотов в борьбе с туберкулезом.
3. Пиразинамид. Вещество, которое оказывает бактерицидное действие на палочку Коха. Он сохраняет активность только в кислой среде — именно такова она в очагах ранних туберкулезных поражений. В ходе лечения очень быстро может возникнуть резистентность, вероятность которой снижает сочетание с другими препаратами.
4. Этамбутол. Препарат, который может помочь в случае устойчивости бактерии к предыдущим четырем. Он быстро проникает внутрь бактериальной клетки, нарушает структуру рибосом, синтез РНК и белка, липидный обмен, связывает ионы магния и меди, а также уничтожает ферменты, участвующие в синтезе клеточной стенки микобактерий, в результате чего бактерии погибают, а выжившие могут быть легко уничтожены другими средствами. Однако микобактерии и к этому препарату вырабатывают устойчивость, блокируя пути поступления этамбутола в клетку.

Вместе эти четыре средства применяют в течение первых двух месяцев, а потом пиразинамид и этамбутол пить прекращают, и следующие четыре месяца принимают только рифампицин и изониазид. Существуют даже специальные препараты с содержанием четырех и двух антибиотиков.

Но при некоторых обстоятельствах может развиться туберкулез с множественной лекарственной устойчивостью, не реагирующий на лечение препаратами первой линии. В этом случае пациенту назначают препараты второй линии — циклосерин, офлоксанцин, амикацин, канамицин и другие препараты. Это антибиотики, отличающиеся высокой стоимостью и большим количеством побочных эффектов, которые назначают только в случае крайней необходимости.

Но иногда и эти препараты оказываются бессильны, и тогда возникает туберкулез с широкой лекарственной устойчивостью. И так как на него не действуют препараты первой и второй линий, выбор терапии в этом случае сильно ограничивается [26]. Что же делать? На этот вопрос пытаются дать ответ ученые по всему миру.

Ноу-хау против чахотки

В поисках точной диагностики

За последние 2–3 года в сфере нахождения новых, приемлемых способов диагностики туберкулеза было сделано очень многое. За это время ученые создали новые методы диагностики, которые далеко ушли вперед по простоте и надежности.

Например, в декабре 2017 года международная группа ученых разработала методику диагностики туберкулеза по анализу мочи, напоминающую обычный тест на беременность. В этом исследовании главным инструментом служит тест-полоска с покрытием на основе комплексного соединения меди, меняющая цвет в присутствии гликолипида липоарабиноманнана (LAM), который есть только в клеточной стенке палочки Коха и нужен ей для обеспечения ее выживания внутри макрофагов. Данный тест имеет высокую чувствительность — он показывает наличие LAM даже на самых ранних стадиях заболевания. Методику уже опробовали на 48 добровольцах c ранее диагностированным туберкулезом, и ее чувствительность превысила 95%. Когда этот метод диагностики поступит в продажу, провериться на наличие палочек Коха можно будет не выходя из дома [27].

Известно, что туберкулезу сопутствует характерный запах, и Кристиан Малдерути вместе с коллегами из Танзании предположил, что его могут почувствовать специально обученные животные с острым нюхом, даже если запах очень слабый. Он и его коллеги знали, что, чтобы вынюхивать мины по запаху взрывчатки, используют хомяковых крыс, и в эксперименте решили обучить крысу по такой же технике, но только с запахом бактерии. После обучения крысам дали понюхать образцы мокроты, взятые у 982 детей в возрасте до пяти лет. У 34 из них ранее был найден туберкулез, и крысы диагноз подтвердили — но попутно они обнаружили его еще у 23 детей, которые считались здоровыми. В дальнейшем оказалось, что и у этих 23 детей туберкулез тоже был, просто бактериоскопическим методом бациллы увидеть не удалось. И когда после крыс образцы мокроты проверили более сложным микроскопом, бактерий там все-таки нашли. Очевидно, хомяковые крысы могли бы помогать медикам обнаруживать туберкулез на ранних стадиях, особенно когда нет возможности использовать сложные и дорогие методы диагностики [28].

К прямым методам обнаружения микобактерий можно отнести и бурно развивающиеся в последние годы подходы, сущность которых состоит в выявлении в образце специфических фрагментов ДНК возбудителя. Среди применяемых для этого молекулярно-биологических методик наиболее распространенным стал метод полимеразной цепной реакции (ПЦР), в основе которого лежит многократное увеличение числа копий специфического участка ДНК: 20 циклов ПЦР приводят к увеличению исходной ДНК в миллион раз, что позволяет визуализировать результаты методом электрофореза в агарозном геле [43]. Очень высокий уровень чувствительности (95% и более), являющийся главным достоинством метода, достигается за счет того, что в результате многократного копирования уровень специфической олигонуклеотидной последовательности в реакционной пробе увеличивается в 106 раз. ПЦР-диагностика туберкулеза строится на использовании последовательностей ДНК, специфичных для всех подвидов туберкулезной микобактерии. Часто для этих целей используют праймеры IS-элементов (это мигрирующие элементы генома, нужные для переноса информации внутри клетки), например, IS-986 или IS-6110, поскольку данные элементы характерны только для видов микобактерий туберкулезной группы [29].

Много десятков лет в медицине для определения инфекций применяют модификации иммуноферментного анализа (ИФА) [44]. Этот метод основан на связывании антигенов с антителами — белками, которые образуются в организме в ответ на вторжение. Стандартный иммуноанализ занимает 3–4 часа, а для визуализации связанных антител обычно используют флуоресцентные метки. Проблема в том, что для работы с образцами с низким содержанием антител у стандартного иммуноанализа не хватает чувствительности.

В лаборатории наноструктур и нанотехнологий ИТЭБ РАН под руководством Виктора Морозова несколько лет назад стали разрабатывать совершенно новый метод иммуноанализа, основанный на электрофорезе. Они усовершенствовали экспресс-иммуноанализ, добившись большой точности для образцов с малой концентрацией маркера инфекции, что позволит выявлять туберкулез, когда болезнь еще не проявилась. Для визуализации связывания молекул антител они использовали магнитные метки. В новой работе им удалось существенно повысить точность метода, установив условия, при которых количество связанных с микрочипом магнитных меток линейно зависит от концентрации анализируемых антител. На целлофановую мембрану ученые наносили пятна секретируемых антигенов туберкулеза и антител к этим антигенам. Получившийся микрочип они помещали в самодельное устройство для электрофореза (проточную ячейку, рис. 12) и пропускали через него плазму крови. Чтобы не ждать, пока молекулы антитела случайно наткнутся на антигены на микрочипе, ученые прикладывали электрическое поле в ячейке так, что отрицательно заряженные антитела смещались из потока в сторону мембраны и концентрировались на микрочипе. Таким образом связывание антител с антигенами происходило очень быстро — этот метод позволяет за 5–10 минут определять сразу несколько антител или антигенов. Далее через ячейку пропускали суспензию магнитных частиц, несущих антитела, которые также буквально за секунды попадали на микрочип. Образцы анализировали под микроскопом, подсчитывая с помощью специального софта число магнитных частиц и сравнивая их с положительным контролем. Количественная оценка в иммуноанализе необходима, чтобы соотносить результаты с показателями неинфицированного человека и так выявлять патологию [30].

На следующем этапе группа Виктора Морозова попыталась диагностировать туберкулез, проанализировав внутрилегочную жидкость. Раньше сделать это было непросто, но исследователи сконструировали простое и дешевое устройство с капроновым фильтром, на котором при выдохе собираются микрокапли легочной жидкости. Испытывали аппарат в Центральном научно-исследовательском институте туберкулеза: 42 пациента из тех, кто еще не проходил лечение, 10 минут дышали в устройство. После этого ученые при помощи того самого микрочипа определяли, есть ли в собранном материале специфические биомаркеры. Оказалось, что живых микобактерий в выдыхаемом воздухе нет, зато там есть антитела, вырабатываемые в организме в ответ на активно размножающуюся палочку Коха. Но у определения антител к микобактериям в выдыхаемом воздухе по сравнению с анализом мокроты есть один минус: точность нового метода составляет лишь 70%. Повысить этот показатель пока не получается из-за того, что у части здоровых людей, долго контактировавших с больными, в легких нарабатываются такие же антитела. В дальнейшем, ученые хотят решить эту проблему, дополнив анализ проверкой на еще один признак инфекции — воспаление в легких, которое можно определить по наличию в выдыхаемом воздухе особых белков [31].

В погоне за инновационным лечением

За последние десять лет достигнут большой прогресс не только в сфере диагностики, но и в области разработки лекарств от туберкулеза.

Чтобы изобрести новое лекарство от инфекции, сначала необходимо найти подходящую мишень — например, какой-нибудь необходимый фермент, который сильно различается в бактериях и в человеке (это нужно, чтобы молекула, блокирующая бактериальный белок, не блокировала ее человеческий аналог) и который можно химически заблокировать.

В середине 2000-х была предложена такая мишень для блокировки — аминоацил-тРНК-синтетаза (АРСаза). АРСаза — это фермент, который ускоряет образование связки аминокислоты с тРНК перед встраиванием последней в синтезируемый белок. АРСазы обеспечивают правильность дальнейшего считывания информации с мРНК при синтезе белков на рибосомах. Для каждой аминокислоты существует своя аминоацил-тРНК-синтетаза. При этом некоторые бактериальные АРСазы зачастую довольно сильно отличаются от эукариотных аналогов, что нам только на руку.

К туберкулезу искатели антибиотиков-ингибиторов АРСазы до сих пор не подобрались потому, что пока не получены трехмерные структуры этих ферментов и не ясно, как определять потенциальные лекарства. Однако первичная структура у некоторых туберкулезных АРСаз, в частности у лейцил-тРНК-синтетазы (ЛРСазы) известна, как и то, какие аминокислоты находятся в активном центре.

Ученые из Украины и Канады решили использовать эту информацию оригинальным образом. Трехмерная структура и точное строение активного центра известны у другой бактериальной ЛРСазы, принадлежащей бактерии Thermus thermophilus. Непосредственно в активном центре сходство их аминокислотных последовательностей равно 95%, в то время как с человеческой ЛРСазой сходство минимально. Используя структуру ЛРСазы T. thermophilus как шаблон, исследователи построили модель ЛРСазы M. tuberculosis.

Теперь в бой вступила хемоинформатика. Ученые взяли базу из 100 000 разных молекул и протестировали их виртуально на предмет взаимодействия с активным центром модели несколькими алгоритмами, часть которых разработали они сами. Это дало возможность сократить список кандидатов до 270, чтобы затем протестировать их экспериментально. Тесты показали, что сильными ингибирующими свойствами обладают шесть молекул, принадлежащие к двум разным классам, которые для простоты обозначили как «молекула 1» и «молекула 2» (рис. 13).

Впоследствии были созданы компьютерные модели молекул 1 и 2, встроенных в активный центр ЛРСазы палочки Коха, с помощью которых можно понять, как именно молекулы взаимодействуют с патогенным ферментом. Используя эти знания, можно оптимизировать структуру молекулы так, чтобы она еще крепче связывалась с активным центром туберкулезной ЛРСазы. Таким образом синтезировали шесть аналогов молекулы 1 и два аналога молекулы 2, которые показали отличные результаты при тестировании их эффективности.

Кроме этого, все молекулы протестировали на предмет ингибирования человеческой ЛРСазы, и во всех случаях их активность к патогенному белку была как минимум в 10 раз выше, что делает их безопасными для человека. Поэтому найденные молекулы являются хорошими кандидатами на роль антитуберкулезных антибиотиков [32].

В число инновационных средств против микобактерий входит также препарат под техническим названием SQ109. Он обладает уникальным многокомпонентным механизмом действия, который заключается в угнетении транспортного фермента mMpl3, участвующего в синтезе корд-фактора — главного оружия палочек Коха. Помимо этого, SQ109 влияет на ферменты, влияющие на транспорт электронов, затрудняя микобактерии дыхание, а также нарушает градиент рН и мембранный потенциал, необходимые для поддержания внутриклеточного транспорта. Результатом такого многостороннего воздействия является мощное угнетение роста микобактерий и низкие показатели лекарственной устойчивости. Препарат одинаково хорошо эффективен как в отношении чувствительных к лекарствам бактерий, так лекарственно-устойчивых штаммов, а также в отношении латентной формы туберкулеза. Кроме того, этот препарат хорош тем, что он безопасен и хорошо переносится пациентами, что немаловажно в случае длительной терапии [33].

Ученые из Каролинского института в Стокгольме выяснили, что комбинация совершенно доступных и неплохо изученных лекарств тоже помогает организму бороться с туберкулезом. Эти лекарства стимулируют организм самостоятельно бороться с бактериями, что снижает риск резистентности. В комплекс входит фенилбутират, используемый для лечения нарушения обмена веществ и помогающий организму вырабатывать «естественные антибиотики» — пептиды. Ученые выяснили, что в сочетании с витамином D препарат позволяет бороться с инфекцией. Кроме теории эти исследователи приводят примеры из практики: экспериментальная комбинация дала эффект при лечении больных в маленькой азиатской стране с населением больше российского — Бангладеш [34].

Одним из самых важных в XXI веке открытий в сфере лечения туберкулеза является изобретение бедаквилина, который синтезировали американские ученые в 2012 году. Его принцип действия основан на совершенно новом принципе, нежели у рифампицина, изониазида, этамбутола и пиразинамида. Это действие (называемое ионофорическим) включает в себя блокирование движения ионов через микобактериальную мембрану, что приводит к превышению критических отметок градиента ионов, необходимых для роста и выживания бактерии. Биоэлектричество, которое создают эти ионы, является ключом к выработке энергии и целой серии других невероятно важных клеточных процессов у бактерии. Нарушение этих ионных градиентов является смертельным для палочки Коха, но до того, как появился бедаквилин, не было лекарств, которые могут сделать это и быть при этом безопасными для человека. Наиболее перспективным аспектом препарата является его способность сокращать сроки лечения до восьми недель, что очень сильно упрощает лечение. Кроме того, бедаквилин используют уже сейчас в некоторых новейших тактиках лечения в качестве препарата первой линии [35].

Команда из нескольких научных центров в США предложила просто натравить микроорганизмы друг на друга (видео 1). План этих исследователей красив и прост: конкурирующие патогены не станут объединяться против лекарства. Вместо этого они начнут убивать друг друга, а врачам затем останется лишь провести зачистку выживших на «поле боя». Таким образом, существующие препараты, к которым патогены уже выработали резистентность, могут вновь стать эффективными. Или же бактерии будут слишком заняты врагами, чтобы развивать устойчивость к лекарствам.

Как же столкнуть между собой микроорганизмы? Чтобы найти способ, исследователи провели несколько испытаний на мышах. Грызуны, впрочем, были заражены малярией, а не бактериальной инфекцией, но для бактерий действуют те же законы природы, что и для остальных организмов. Зато ученые использовали сразу две линии малярийных плазмодиев — поддающийся лечению штамм и устойчивый к существующим лекарствам. Сначала животным, зараженным чувствительной к лекарствам малярией, вместе с водой давали питательное для паразита вещество. Причем «подкормка» содержалась в разных количествах: кому-то досталось больше «удобрения», кому-то меньше. Затем мыши прошли курс терапии при помощи одних и тех же лекарств. Когда грызуны получали питательное вещество, лечение проваливалось в 40% случаев. Тесты подтвердили, что это происходило из-за появления устойчивых к терапии штаммов. Но, когда ученые ограничили объем питательного раствора, выздоровели все мыши, то есть ученые предотвратили появление резистентности.

Затем команда убедилась, что положительные результаты были вызваны именно конкуренцией среди паразитов, а не каким-либо другим эффектом ограничения еды. Ученые заразили часть мышей только устойчивыми к лечению паразитами, а другую группу — устойчивыми и чувствительными. Оказалось, что, когда мышей инфицировали только устойчивыми штаммами, а питательное вещество было ограничено, резистентные паразиты выживали. Но если животные были инфицированы как чувствительными к лечению, так и устойчивыми штаммами, число резистентных паразитов не росло. Даже если их при этом в организме животных было гораздо больше, чем обычно на первоначальных этапах, когда происходит заражение. Судя по всему, между линиями паразитов развивалась конкуренция за корм, поступавший в ограниченных количествах. Иными словами, естественная конкуренция — это и есть слабое место возбудителей инфекций.

Для возбудителей различных болезней (например, туберкулеза) предстоит определить свой «лакомый кусочек» — то самое питательное вещество, за которое они начнут бороться. Кроме того, исследователям нужно суметь выбрать наилучший момент для того, чтобы начать эту борьбу [36].

В следующем исследовании использовали этионамид — один из препаратов второй линии, который назначают в случае неудачи при лечении классическими четырьмя антибиотиками. Как известно, сам он не активен до того, как вступит в реакцию с бактерией и перейдет в активную форму. Эта активация происходит с помощью специального гена ethA, который кодирует фермент, превращающий этионамид в токсин, и обычно лекарство сопровождают еще специальные вещества, стимулирующие работу этого гена. Ученые ранее описали соединения, которые могут стимулировать активность ethA, но они не влияют на штаммы с мутацией в этом гене, делающей их устойчивыми к этионамиду. В этот раз исследователи обнаружили новый ген, который также превращает этионамид в активную форму даже тогда, когда ethA — мутант. Этот ген, получивший название ethA2, у Mtb обычно неактивен. Но ученые нашли вещество, SMARt-420, которое удивительным образом увеличило активность ethA2, сделав этионамид настоящим киллером бактерий, причем даже тех, у кого есть устойчивость к этионамиду из-за мутации ethA. Раз SMARt-420 увеличивает эффективность этионамида, то можно снизить его количество, а значит и побочные эффекты можно будет минимизировать.

Конечно, есть вероятность, что у бактерий возникнет устойчивость и к SMARt-420. Чтобы этого не случилось, следует использовать это вещество с перерывами: если в популяции и появятся клетки с новой устойчивостью, их сначала будет слишком мало, так что потом, когда SMARt-420 временно исчезнет, их вытеснят обычные микробы. Впрочем, как именно использовать SMARt-420, станет ясно после клинических испытаний, которые должны начаться уже очень скоро [37].

На конференции по ретровирусам и оппортунистическим инфекциям, прошедшей в Сиэтле, авторы еще одного интересного исследования из объединения TB Alliance рассказали об успешных испытаниях сразу двух терапий лекарственными препаратами. Новые методы, которые сделают лечение проще и эффективнее, получили названия BPaMZ и BPaL — по сокращенным названиям уже известных антибиотиков, которые ранее не пробовали сочетать.

Первый метод включает в себя прием четырех препаратов (уже знакомого нам бедаквилина, а также претоманида, моксифлоксацина и пиразинамида) раз в сутки. BPaMZ прошел испытания с участием 240 человек в десяти странах Африки. В течение четырех месяцев эта терапия помогла излечить почти все случаи обычного заболевания, а на борьбу с устойчивым видом болезни ушло шесть месяцев. Чаще всего основная часть бактерий выходила с мокротой в течение первых двух месяцев.

Второй метод — BPaL — сочетает три антибиотика (бедаквилин, претоманид и линезолид), которые принимаются раз в день. Из 69 пациентов, которых лечили при помощи этой методики, в 40 случаях испытания прошли успешно: через шесть месяцев терапии болезнь отступила, причем речь шла о самой сложной форме с широкой лекарственной устойчивостью.

По словам авторов новых методов, первый вид терапии имеет потенциал лечения до 99% пациентов с разными формами туберкулеза. Оставшийся 1% «берет на себя» второй вид лечения. Однако еще необходимо провести более масштабные испытания и провести официальное утверждение новых методов, поскольку препарат претоманид все еще является экспериментальным. Все это может занять не менее трех лет, но результат того стоит.

Индийские исследователи недавно обнаружили, что Pranlukast — препарат, который используется для лечения астмы, также может бороться и с туберкулезом. Оказалось, что, когда этот препарат используется сам по себе или, что еще лучше, вместе с рифампицином, он лечит от туберкулеза намного лучше, чем комбинированные препараты первой линии. Препарат борется с бактериями туберкулеза так, чтобы не наносить вреда хорошим бактериям, и поэтому не вызывает побочных эффектов — он подавляет синтез фермента орнитинацетилтрансферазы (ArgJ), который есть только у палочки Коха и некоторых других болезнетворных микробов и не обнаружен у людей. Этот фермент является ключевым предшественником аргинина, который необходим для выживания и патогенеза бактерии [38].

Также людям необходимы новые, более эффективные вакцины для профилактики туберкулеза, которые в состоянии заменить «старушку» БЦЖ, являющуюся далеко не универсальным средством — ведь штаммы туберкулезной палочки невероятно разнообразны. Единственной альтернативной вакциной, которую сейчас могут предложить ученые, является Н4:IC31. Она содержит рекомбинантный белок TB10. Ученые оценили безопасность и иммуногенность H4:IC31 у взрослых на практическом опыте: они применяли вакцину в Южной Африке в условиях эпидемии туберкулеза, наблюдая за привитыми. Как оказалось, самым неблагоприятным побочным эффектом оказалась лишь общая усталость, зато у вакцины хорошо получилось отпечатать рекомбинантный белок в клеточной памяти, в результате чего до самого конца наблюдений иммунитет справлялся с туберкулезом [39].

Проект EteRNA

Очень интересно подошли к делу ученые из медицинской школы Стэнфордского университета. Они создали новую версию браузерной компьютерной игры EteRNA Medicine, которая будет использовать творческие способности тысяч игроков, чтобы создать спасительное средство для диагностики туберкулеза.

EteRNA — это «игра с целью», которая привлекает пользователей к решению головоломок, связанных со складыванием различных молекул РНК, необходимых в тех или иных исследованиях. Этот проект поддерживается Фондом Билла и Мелинды Гейтс, Стэнфордским университетом и Национальными институтами здравоохранения.

Смысл игры заключается в том, чтобы сложить нить РНК, которая будет соответствовать поставленному условию задачи. Игрок может изменить последовательность, помещая любой из четырех нуклеотидов РНК в разные положения. РНК, в зависимости от последовательности нуклеотидов, может самопроизвольно сгибаться в мириады всевозможных форм. И от того, как сложится РНК, может зависеть очень многое, в том числе и то, как она может связываться с другими молекулами РНК. На этом и основан новый тест, разрабатываемый учеными из Стэнфорда.

Специалисты намерены с помощью игроков разработать молекулу РНК, которая будет главным героем в новом тесте, анализирующем образец крови. Эту искомую молекулу уже заочно назвали OpenTB. Тест «высчитывает» соотношение в образце трех молекул РНК, принадлежащих палочке Коха и больному. Две из них в большом количестве можно найти в образце, когда человек болен. Третий же вид РНК служит порогом — если молекул первых двух видов больше, чем третьего, то это и является признаком заражения. OpenTB сможет связаться с этими тремя молекулами, и на основании того, как это произошло, можно сделать вывод, болен ли человек (видео 2).

Хотя OpenTB будет одной молекулой РНК, она будет иметь три части, каждая из которых связывается с одной из трех связанных с туберкулезом молекул РНК. OpenTB должна также принимать различные формы в зависимости от пропорций трех видов РНК. Если у больного много молекул РНК первых двух видов (присущих больным людям), то OpenTB сложится в форму 1. Но если представителей этих двух видов молекул меньше, чем третьего, то OpenTB сложится в форму 2. Форма 1 также должна быть в состоянии связаться с флуоресцентным тегом, в то время как форма 2, наоборот, не должна. Поэтому молекулы с формой 1 будут излучать свет, а с формой 2 — нет. Измеряя яркость свечения, можно сделать вывод, болен ли человек или нет: если она выше некоторого порога, то пациент имеет активный туберкулез.

За полтора года после запуска проекта биологи получили десятки тысяч конструкций, из которых они выбрали несколько действительно многообещающих проектов. Проверив их, они синтезировали РНК в лаборатории для дальнейших проверок и исследований. По состоянию на 2018 год, тестирование продолжается с помощью реальных образцов крови, взятых у пациентов.

Если это исследование окажется успешным, оно поможет спасти миллионы жизней. Ведь на данный момент все еще не существует простого анализа крови, который может обнаружить активную инфекцию, и который можно сдавать больше одного раза в год, чтобы с бóльшей долей вероятности диагностировать туберкулез на ранней стадии.

Первую версию игры Eterna запустили 7 лет назад для того, чтобы позволить обыкновенным людям, не имеющим отношения к миру науки, создать потенциально полезные биомолекулы. Такие молекулы должны быть достаточно стабильны, чтобы функционировать внутри клеток. За прошедшие годы вчерашние простые геймеры все больше узнавали эту область, становясь параллельно экспертами в построении сложных молекул. Более того, некоторые из них стали даже соавторами научных работ в области молекулярной биологии.

Заключение

К сожалению, несмотря на всю вышеописанную работу ученых, и активный поиск решения проблемы борьбы с туберкулезом, на сегодняшний день эта болезнь все еще не побеждена. Но, из всего сказанного мы можем прийти к выводу: несмотря на то, что палочка Коха пока что успешно сопротивляется, ученые придумали и продолжают придумывать новые средства, которые должны стать стеной на страже нашего здоровья, заменить уже знакомые нам. Помогут ли новые технологии в борьбе против туберкулеза? Безусловно, да. Все говорит о том, что ученые медленно, но верно приближаются к тому, чтобы выполнить программу ВОЗ по искоренению туберкулеза. И когда эти и другие средства выйдут за пределы лабораторий, то можно будет с полной уверенностью сказать: «Туберкулез побежден!». Это лишь вопрос времени...

Литература

1. Dodd P. and Houben R. (2016). New estimate suggests a quarter of the world’s population has latent tuberculosis. The Conversation;
2. What is multidrug-resistant tuberculosis (MDR-TB) and how do we control it? (2018). Сайт WHO;
3. Tuberculosis: in it for the long haul. An interview with Brigitte Gicquel. (2008). Bulletin of the WHO. 9, 657–736;
4. Туберкулез с широкой лекарственной устойчивостью (ШЛУ-ТБ). Сайт ВОЗ;
5. Edith NG Houben, Liem Nguyen, Jean Pieters. (2006). Interaction of pathogenic mycobacteria with the host immune system. Current Opinion in Microbiology. 9, 76-85;
6. Marie-Laurence Lambert, Epco Hasker, Armand Van Deun, Dominique Roberfroid, Marleen Boelaert, Patrick Van der Stuyft. (2003). Recurrence in tuberculosis: relapse or reinfection?. The Lancet Infectious Diseases. 3, 282-287;
7. H. D. Donoghue, O. Y.-C. Lee, D. E. Minnikin, G. S. Besra, J. H. Taylor, M. Spigelman. (2010). Tuberculosis in Dr Granville's mummy: a molecular re-examination of the earliest known Egyptian mummy to be scientifically examined and given a medical diagnosis. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 277, 51-56;
8. Dawid Surmik, Tomasz Szczygielski, Katarzyna Janiszewska, Bruce M. Rothschild. (2018). Tuberculosis-like respiratory infection in 245-million-year-old marine reptile suggested by bone pathologies. R. Soc. open sci.. 5, 180225;
9. Пироговская М. (2018). Чахотка в XIX веке. Научный корреспондент;
10. Туберкулез выявление, лечение и мониторинг по К. Томену / Под ред. Т. Фридена, пер. с англ., 2-ое издание. Женева: Всемирная организация здравоохранения, 2006. — С. 101;
11. Esmond R. Long and Florence B. Seibert. (2012). Chemical Heritage Foundation;
12. Ubaidi Basem Abbas Al. (2018). The Radiological Diagnosis of Pulmonary Tuberculosis (TB) in Primary Care. J Fam Med Dis Prev. 4;
13. Об ограничении облучения населения при проведении рентгенорадиологических медицинских исследований. (2006). Постановление Главного государственного санитарного врача Г.Г. Онищенко № 11;
14. Методические рекомендации по обеспечению радиационной безопасности. (2007);
15. Sources and effects of ionizing radiation. NY: United Nations, 2008. — 683 p.;
16. Patricio Escalante. (2009). Tuberculosis. Ann Intern Med. 150, ITC6-1;
17. V. N. Zimina, O. E. Mikova, T. A. Varetskaya, D. A. Oborin, S. Yu. Degtyareva, V. I. Sergevnin. (2017). The spectrum of primary drug resistance of Mycobacterium tuberculosis in patients with tuberculosis in relation to human immunodeficiency virus status. Ter. arkh.. 89, 50;
18. J.S. McCormac. (1937). The pottenger method of sputum examination as modified by Dr. Peter Edwards. Tubercle. 18, 187;
19. Голышевская В.И., Егорова О.В., Севастьянова Э.В., Шульгина М.В. Люминесцентная микроскопия: Учебное пособие для проведения курсов обучения: «Культуральные методы диагностики туберкулеза», «Выявление туберкулеза методом микроскопии». Москва—Тверь: ООО «Издательство “Триада”», 2008. — 36 с.;
20. Aksenova V.A., Klevno N.I., Baryshnikova L.A., Dolzhenko E.N., Iliasova E.V., Medvedev SIu. et al. (2009). Diaskintest for tuberculosis in children and adolescents. Tuberk. Biolezni Legkih. 10, 13–16;
21. Bertolaccini L., Viti A., Di Perri G., Terzi A. (2013). Surgical treatment of pulmonary tuberculosis: the phoenix of thoracic surgery? J. Thorac. Dis. 5, 198–199;
22. Fine P.E.M., Carneiro I.A.M., Milstien J.B., Clements C.J. Issues relating to the use of BCG in immunisation programmes. Geneva: World Health Organization, 1999. — 42 p.;
23. Schatz A. (1993). The true story of the discovery of streptomycin. Actinomycetes. 4, 27–39;
24. Bharati Pandey, Sonam Grover, Sukriti Goyal, Salma Jamal, Aditi Singh, et. al.. (2018). Novel missense mutations in gidB gene associated with streptomycin resistance in Mycobacterium tuberculosis: insights from molecular dynamics. Journal of Biomolecular Structure and Dynamics. 1-16;
25. Stephen D Lawn, Alimuddin I Zumla. (2011). Tuberculosis. The Lancet. 378, 57-72;
26. Nolan C.M. and Goldberg S.V. (2002). Treatment of isoniazid-resistant tuberculosis with isoniazid, rifampin, ethambutol, and pyrazinamide for 6 months. Int. J. Tuberc. Lung. Dis. 6, 952–958;
27. Luisa Paris, Ruben Magni, Fatima Zaidi, Robyn Araujo, Neal Saini, et. al.. (2017). Urine lipoarabinomannan glycan in HIV-negative patients with pulmonary tuberculosis correlates with disease severity. Sci. Transl. Med.. 9, eaal2807;
28. Georgies F Mgode, Christophe L Cox, Stephen Mwimanzi, Christiaan Mulder. (2018). Pediatric tuberculosis detection using trained African giant pouched rats. Pediatr Res. 84, 99-103;
29. Iker A. Sevilla, Elena Molina, Natalia Elguezabal, Valentín Pérez, Joseba M. Garrido, Ramón A. Juste. (2015). Detection of Mycobacteria, Mycobacterium avium Subspecies, and Mycobacterium tuberculosis Complex by a Novel Tetraplex Real-Time PCR Assay. J. Clin. Microbiol.. 53, 930-940;
30. Yuri M. Shlyapnikov, Victor N. Morozov. (2017). Titration of trace amounts of immunoglobulins in a microarray-based assay with magnetic labels. Analytica Chimica Acta. 966, 47-53;
31. Victor N Morozov, Alexander A Nikolaev, Yuri M Shlyapnikov, Andrei Y Mikheev, Elena A Shlyapnikova, et. al.. (2018). Non-invasive approach to diagnosis of pulmonary tuberculosis using microdroplets collected from exhaled air. J. Breath Res.. 12, 036010;
32. Olga I. Gudzera, Andriy G. Golub, Volodymyr G. Bdzhola, Galyna P. Volynets, Sergiy S. Lukashov, et. al.. (2016). Discovery of potent anti-tuberculosis agents targeting leucyl-tRNA synthetase. Bioorganic & Medicinal Chemistry. 24, 1023-1031;
33. Kapil Tahlan, Regina Wilson, David B. Kastrinsky, Kriti Arora, Vinod Nair, et. al.. (2012). SQ109 Targets MmpL3, a Membrane Transporter of Trehalose Monomycolate Involved in Mycolic Acid Donation to the Cell Wall Core of Mycobacterium tuberculosis. Antimicrob. Agents Chemother.. 56, 1797-1809;
34. Rokeya Sultana Rekha, SSV Jagadeeswara Rao Muvva, Min Wan, Rubhana Raqib, Peter Bergman, et. al.. (2015). Phenylbutyrate induces LL-37-dependent autophagy and intracellular killing of Mycobacterium tuberculosis in human macrophages. Autophagy. 11, 1688-1699;
35. Kiel Hards, Duncan G. G. McMillan, Lici A. Schurig-Briccio, Robert B. Gennis, Holger Lill, et. al.. (2018). Ionophoric effects of the antitubercular drug bedaquiline. Proc Natl Acad Sci USA. 115, 7326-7331;
36. McCormick G. (2017). Turning pathogens against each other to prevent drug resistance. The Pennsylvania State University;
37. Nicolas Blondiaux, Martin Moune, Matthieu Desroses, Rosangela Frita, Marion Flipo, et. al.. (2017). Reversion of antibiotic resistance inMycobacterium tuberculosisby spiroisoxazoline SMARt-420. Science. 355, 1206-1211;
38. Archita Mishra, Ashalatha S Mamidi, Raju S Rajmani, Ananya Ray, Rajanya Roy, Avadhesha Surolia. (2018). An allosteric inhibitor of Mycobacterium tuberculosis ArgJ: Implications to a novel combinatorial therapy. EMBO Mol Med.. 10, e8038;
39. Hennie Geldenhuys, Helen Mearns, David J.C. Miles, Michele Tameris, David Hokey, et. al.. (2015). The tuberculosis vaccine H4:IC31 is safe and induces a persistent polyfunctional CD4 T cell response in South African adults: A randomized controlled trial. Vaccine. 33, 3592-3599;
40. Кох и все его палочки;
41. Т-лимфоциты: путешественники и домоседы;
42. Главный «почвенник» медицины: Зельман Ваксман;
43. 12 методов в картинках: полимеразная цепная реакция;
44. 12 методов в картинках: иммунологические технологии.