Однажды в 1991 году невролог Уоррен Стриттмэттер (Warren Strittmatter) попросил своего руководителя — директора Дьюковского университета Аллена Роузеса (Allen Roses) — взглянуть на результаты своего эксперимента. Стриттмэттер изучал бета-амилоид (Aβ) — основной компонент молекулярных сгустков, обнаруженных в мозге людей с деменцией альцгеймеровского типа . Он искал в спинномозговом ликворе белки, связывающиеся с амилоидом, и в результате наткнулся на аполипопротеин Е (ApoE), который, вроде бы, не имел прямой связи с развитием болезни.

Бета-амилоид, образующий при болезни Альцгеймера нерастворимые бляшки в нервных клетках, традиционно считался основной причиной нейротоксичности при этом заболевании, однако в действительности дело обстоит не так просто. В частности, токсичными могут быть не только фибриллярные, но и промежуточные сферические агрегаты Aβ (см. «Альцгеймеровский нейротоксин: ядовиты не только фибриллы» [14]), на вероятность развития БА положительно влияет недосып (см. «Новый шаг к пониманию болезни Альцгеймера: возможно, недосыпание является одним из факторов риска» [15]), ну а на сладкое — в реальности бета-амилоид может быть вообще не нейротоксином, а компонентом врождённого иммунитета в нервной системе человека (см. «Возможно, β-амилоид болезни Альцгеймера — часть врождённого иммунитета» [16]). — Ред.

Профессор Роузес сразу понял, что его коллега нашел нечто важное. Двумя годами ранее ими было обнаружено, что экспрессия некоторых генов из хромосомы 19 способствует развитию деменции, а поскольку Роузес знал, что ген, кодирующий ApoE, также находится на этой хромосоме, его молниеносно осенила идея участия ApoE в развитии болезни Альцгеймера (БА).

В организме человека есть три варианта гена APOE, кодирующих изоформы белка Е2, Е3 и Е4, и Роузес решил выяснить их влияние на развитие болезни Альцгеймера. Для определения отдельных аллелей нужно было провести полимеразную цепную реакцию (ПЦР) [17]. Так как ученый имел весьма скромный опыт работы с ПЦР, он хотел привлечь в свою команду нейрофизиологов, но получил отказ: хотя они и были заняты охотой за генами, которые лежат в основе болезни Альцгеймера, АРОЕ показался им неподходящим кандидатом. Роузес вспоминает, как позже в лаборатории ходили разговоры: «...начальник совсем потерял голову от своих безумных идей».

Но Роузес не сдавался. Он попросил помощи у своей жены, генетика Энн Сондерс (Ann Saunders), которая использовала ПЦР в своих исследованиях. Она только что родила дочь и была в декретном отпуске, и потому они заключили соглашение. «Она сделала все эксперименты, пока я присматривал за ребенком», — говорит профессор. В течение трех недель супруги собрали данные, которые в дальнейшем легли в основу серии знаковых публикаций. Они выяснили, что аллель APOE4 способствует развитию БА [1].

Сегодня, двадцать лет спустя, APOE4 остается ведущим фактором риска для наиболее распространенной формы деменции. Наследование одной копии APOE4 вчетверо повышает риск возникновения заболевания, двух копий — в 12 раз (рис. 1). Однако данные Роузеса в основном не воспринимали всерьез или критиковали. Впоследствии, даже когда мнение об ApoE поменялось, большинство ученых все равно продолжали работать с β-амилоидом, как бы «зациклившись» на классике. Но некоторые лаборатории все равно исследовали ApoE, несмотря на равнодушие финансирующих учреждений и научного сообщества и на отсутствие ресурсов, необходимых для проведения масштабных экспериментов.

Долгое время было неизвестно, какие функции белок ApoE выполняет в головном мозге, и постепенно эта головоломка стала интересовать многих нейрофизиологов. Интерес к липопротеинам продолжал расти, — отчасти потому, что клинические испытания лекарств, нацеленных на β-амилоид, часто заканчивались неудачей. Многие исследователи начали скрупулезно изучать белок ApoE4 и, как следствие, привлекли внимание фармацевтических компаний. «Амилоидные подходы» постепенно перестали использовать, зато начали разрабатывать препараты, направленные на аполипопротеин.

«Несмотря на отсутствие уверенных доказательств, амилоидная гипотеза стала в свое время сильным научным постулатом», — говорит Завен Хачатурян, президент некоммерческой компании «Предотвратим Болезнь Альцгеймера» (Prevent Alzheimer’s Disease 2020) и бывший координатор деятельности, связанной с исследованием БА в Национальных институтах здоровья США. До недавнего времени, по его словам «никто не пытался задать фундаментальный вопрос — правильно ли мы определили основную предпосылку болезни?».

Жесткая конкуренция

Существуют разные доводы относительно того, почему открытие Роузеса было проигнорировано. Многие сходятся во мнении, что генетик выбрал неудачное время для обнародования своих результатов. В 1991 году Джон Харди (John Hardy) и Дэвид Олсоп (David Allsop) предложили «гипотезу амилоидного каскада». Они утверждали, что болезнь Альцгеймера является результатом аномального накопления β-амилоидных бляшек в тканях мозга [3]. Научное сообщество поддержало предложенную идею, которую вскоре начали активно финансировать.

Но Роузес не подписался под этой теорией: «...амилоиды являются одними из многих веществ, которые формируют бляшки; в конечном итоге они разрушают клетки и вызывают атрофию мозга. У меня и мысли не было, что это было причиной деменции». Говоря так, он, возможно, хотел скрыть возможную связь ApoE/Аβ, и случайно создал конкуренцию между двумя гипотезами за финансирование. К сожалению, Роузес так и не получил гранты для работы с ApoE.

Были и технические препятствия для изучения ApoE. Белок входит в состав различных липопротеинов плазмы крови и является довольно сложной фармакологической мишенью при работе с головным мозгом. ApoE имеет липофильную часть и поэтому при биохимическом анализе может агрегировать с другими молекулами. Работа с такими белками требует глубокого понимания биохимии липопротеинов и методик работы с ними.

Амилоид же, наоборот, был легкой мишенью. После двух десятилетий тщательных наблюдений был создан ряд лекарств, которые изменяют метаболизм Aβ, но они до сих пор не оправдали ожиданий. Из шести препаратов, проходивших клинические испытания на больных со II или III стадией заболевания в 2012 году, половина сразу же отпала из соображений безопасности или отсутствия эффективности. И эта ситуация происходит на фоне старения населения, шаткости системы здравоохранения и нехватки лекарств для болезни Альцгеймера. «Количество неудачных испытаний, направленных на лечение деменции Альцгеймера, резко возросло», — говорит Леннарт Мак (Lennart Mucke), директор Гладстонского института неврологических заболеваний (Калифорнийский университет, Сан-Франциско). — «Это действительно пошатнуло фармацевтическую индустрию».

Три оставшихся препарата, которые нацелены на β-амилоид, в настоящее время проходят испытания на больных, а также на людях с высоким риском БА, у которых еще не развились симптомы. Позитронно-эмиссионная томография показала, что мозг подопытных с высоким риском развития БА отличается от здорового мозга за десятилетия (!) до того, как начинает накапливаться β-амилоид или разрушаться нейроны [4]. В результате исследований, которые будут проводиться в течение следующих шести лет, ученые поймут, способны ли данные лекарства отсрочить наступление заболевания или нет. Среди исследователей и представителей фармацевтической индустрии появилось ощущение, что это — последний шанс для амилоидной гипотезы. На фоне этих сомнений ApoE вновь оказался в центре внимания.

По словам Мака, если испытания закончатся неудачей, ученые будут отчитываться перед инвесторами, предоставляя все данные доклинических и ранних клинических испытаний. Он надеется, что исследователи АроЕ вскоре получат большое преимущество. Несмотря на препятствия в этой области, у ученых продолжает крепнуть подозрение, что именно ApoE4 является предпосылкой для возникновения болезни. Этот факт подтверждают группы Мака и Гольцмана (Holtzman) в опытах на трансгенных мышах, которые несут в себе изоформы ApoE человека.

Скорее всего, ApoE участвует в развитии БА двумя различными путями, один из которых — амилоид-зависимый. И у животных, и у человека ApoE4 способствует отложению Aβ в мозговом веществе, в то время как ApoE3 считается «нейтральной» изоформой, а ApoE2 — «защитной» формой, уменьшающей накопление бляшек [5]. «Это достаточно убедительные данные», — говорит Хольцман.

Другой механизм не предусматривает взаимосвязи с амилоидом. Когда нейроны находятся в состоянии стресса, они экспрессируют ApoE для своего восстановления. «Плохая» форма — ApoE4, — как правило, разрушается на токсичные фрагменты, которые повреждают митохондрии и модифицируют цитоскелет.

Оценить вклад этих двух механизмов в риск развития болезни Альцгеймера крайне сложно, говорит Хольцман, но он и его коллеги считают, что трансформация вредоносной изоформы ApoE в «нейтральную» может стать перспективным подходом для лечения БА. В Гладстоне исследователи начали изучать этот вопрос, и уже найдены небольшие регуляторные молекулы, которые трансформируют ApoE4 в ApoE3-образный белок и тем самым снижают аномальную фрагментацию первого [7]. В культуре клеток даже низкие концентрации этих молекул могут уменьшить разрушение митохондрий и дисфункцию нейронов [8]. В настоящее время эти молекулы проходят испытания на животных, и если они в конечном счете окажутся безопасными и эффективными, врачи будут назначать их пациентам, предрасположенных к БА, так же, как статины — больным с высоким уровнем холестерина и с повышенным риском сердечно-сосудистых заболеваний.

Более чем достаточно

Такие препараты могут быть эффективными и для лечения других болезней. «Митохондриальная гипотеза достаточно логично и лаконично объясняет, к чему приводит экспрессия ApoE4, — говорит Мак, — не только в контексте болезни Альцгеймера, но, возможно, также и при других заболеваниях». Существует доказательство того, что появление этой изоформы — возможный фактор риска также при болезни Паркинсона и эпилепсии. Данный белок также связывают с развитием деструктивных процессов после черепно-мозговой травмы и ускоренным развитием ВИЧ-инфекции. Пятнадцать биотехнологических компаний уже сотрудничают с Гладстоном для разработки лекарственных веществ, действующих по схожему принципу.

Несмотря на отсутствие грантов на исследования ApoE, Роузес никогда не сдавался. Но через несколько лет, когда его группа обнаружила связь между ApoE и болезнью Альцгеймера, он устал от постоянного денежного противостояния и оставил науку. Проработав в фармацевтической индустрии десять лет, в течение которых он не переставал исследовать ApoE, в 2008 году он снова возвращается в Дьюковский университет.

В 2009 году его группа описала участок некодирующей ДНК с геном TOMM40, который располагается рядом с APOE на девятнадцатой хромосоме. Этот участок ДНК (сокращенно — 523) варьирует по длине и, в зависимости от этого, может определять уровень экспрессии генов TOMM40 и АРОЕ [9].

По словам Роузеса, это было важное открытие, так как белок, кодируемый геном TOMM40 — Tom40, — является необходимым для «здоровых» митохондрий. Tom40 образует канал во внешней митохондриальной мембране, через который импортируются белки, необходимые для нормального деления этой органеллы. «Мы знали о существовании такого механизма в течении 10 лет, — говорит ученый, — но то, что он приводит к болезни Альцгеймера, мы и не подозревали».

Роузес продолжал утверждать, что участок 523 можно использовать для разработки терапии и более точного предсказания болезни. Подавляющее большинство людей рискует встретиться со своим Альцгеймером, если только проживет достаточно долго, а ведь носителями аллеля APOE4 являются только 25% населения. Значит, тест на носительство этого аллеля никогда не будет до конца точным предиктором. Но генотипирование по обоим генам — АРОЕ и TOMM40 — может существенно увеличить точность, как говорит Роузес. В его лаборатории открыли, что APOE3 — наиболее частая изоформа — обычно наследуется вместе или с коротким, или с очень длинным участком 523. И у носителей двух аллелей APOE3 возраст наступления заболевания будет зависеть от конкретного варианта участка 523, наследуемого вместе с APOE.

Некоторым лабораториям удалось найти доказательства, подтверждающие гипотезу Роузеса, однако у других повторить исследования на TOMM40 так и не удалось, и возникли сомнения в реальности влияния этого гена на риск развития БА [10]. Однако Роузес не сомневается в правильности своих гипотез и считает, что геномные исследования, не подтвердившие его результатов, обладали недостаточной силой для выявления сцепливания TOMM40 и болезни Альцгеймера.

Роузес надеется, что вскоре он сможет подкрепить свои результаты клиническими исследованиями, которые будут проводиться в основанной им компании Zinfandel Pharmaceuticals. Вместе с японской фармацевтической компанией Takeda Зинфандель в настоящее время финансирует фазу III клинических испытаний (под названием TOMMORROW), призванную проверить идеи Роузеса на деле. TOMMORROW должна оценить риски развития БА в зависимости от возраста пациента и вариантов APOE и TOMM40. Для запуска программы будут отобраны около 6000 здоровых пожилых людей, и исследования будут продолжаться около 5 лет.

Программа будет также исследовать возможность того, что пиоглитазон — препарат для лечения пациентов с сахарным диабетом 2 типа, — в малых дозах будет задерживать развитие БА у лиц, отнесенных к группе высокого риска развития болезни Альцгеймера. Проверка этой идеи вызвана тем, что опубликованы результаты опытов на животных и даже на людях, которые говорят о способности пиоглитазона предотвращать или уменьшить патологию и симптомы, связанные с болезнью Альцгеймера [11]. Роузес думает, возможный механизм этого — стимуляция деления митохондрий.

Даже если получить мощное лекарство против болезни Альцгеймера так и не удастся, толк в этих испытаниях все равно будет: научившись задерживать развитие БА хотя бы на два года, можно уменьшить число больных в США через 50 лет на 2 млн. человек, что очень и очень неплохо [12]. Кроме того, результаты этих испытаний заставят исследователей всего мира по-новому взглянуть на деменцию. Такое сложное расстройство, как болезнь Альцгеймера, нельзя изучать только с одной стороны, — пусть и включающей ApoE4 или еще что-нибудь. По-видимому, нейрофизиологи близки к тому, чтобы признать ограниченность своих прежних взглядов и частично пересмотреть их, направив исследования по новым дорожкам, в конце которых будет разгадка проблемы, лишающей нас ума.

По материалам рубрики News Feature в Nature [13].

Литература

1. W. J. Strittmatter, A. M. Saunders, D. Schmechel, M. Pericak-Vance, J. Enghild, et. al.. (1993). Apolipoprotein E: high-avidity binding to beta-amyloid and increased frequency of type 4 allele in late-onset familial Alzheimer disease.. Proceedings of the National Academy of Sciences. 90, 1977-1981;
2. Jacob Raber, Yadong Huang, J.Wesson Ashford. (2004). ApoE genotype accounts for the vast majority of AD risk and AD pathology. Neurobiology of Aging. 25, 641-650;
3. John Hardy, David Allsop. (1991). Amyloid deposition as the central event in the aetiology of Alzheimer's disease. Trends in Pharmacological Sciences. 12, 383-388;
4. Nicola Filippini, Bradley J. MacIntosh, Morgan G. Hough, Guy M. Goodwin, Giovanni B. Frisoni, et. al.. (2009). Distinct patterns of brain activity in young carriers of the APOE-ε4 allele. PNAS. 106, 7209-7214;
5. Jungsu Kim, Jacob M. Basak, David M. Holtzman. (2009). The Role of Apolipoprotein E in Alzheimer's Disease. Neuron. 63, 287-303;
6. Tim Fulmer. (2012). APOE in AD. Science-Business eXchange. 5, 221-221;
7. Robert W. Mahley, Yadong Huang. (2012). Small-Molecule Structure Correctors Target Abnormal Protein Structure and Function: Structure Corrector Rescue of Apolipoprotein E4–Associated Neuropathology. J. Med. Chem.. 55, 8997-9008;
8. Hung-Kai Chen, Zhaoping Liu, Anke Meyer-Franke, Jens Brodbeck, Rene D. Miranda, et. al.. (2012). Small Molecule Structure Correctors Abolish Detrimental Effects of Apolipoprotein E4 in Cultured Neurons. J. Biol. Chem.. 287, 5253-5266;
9. Colton Linnertz, Lauren Anderson, William Gottschalk, Donna Crenshaw, Michael W. Lutz, et. al.. (2014). The cis -regulatory effect of an Alzheimer's disease-associated poly-T locus on expression of TOMM40 and apolipoprotein E genes. Alzheimer's & Dementia. 10, 541-551;
10. Rita J. Guerreiro, John Hardy. (2012). TOMM40 Association With Alzheimer Disease. Arch Neurol. 69, 1243;
11. Tomohiko Sato, Haruo Hanyu, Kentaro Hirao, Hidekazu Kanetaka, Hirofumi Sakurai, Toshihiko Iwamoto. (2011). Efficacy of PPAR-γ agonist pioglitazone in mild Alzheimer disease. Neurobiology of Aging. 32, 1626-1633;
12. R Brookmeyer, S Gray, C Kawas. (1998). Projections of Alzheimer's disease in the United States and the public health impact of delaying disease onset.. Am J Public Health. 88, 1337-1342;
13. Laura Spinney. (2014). Alzheimer's disease: The forgetting gene. Nature. 510, 26-28;
14. Альцгеймеровский нейротоксин: ядовиты не только фибриллы;
15. Новый шаг к пониманию болезни Альцгеймера: возможно, недосыпание является одним из факторов риска;
16. Возможно, β-амилоид болезни Альцгеймера — часть врождённого иммунитета;
17. 12 методов в картинках: полимеразная цепная реакция.